Repositório Colecção: Dissertações de MestradoDissertações de Mestradohttps://hdl.handle.net/1822/10292024-03-29T13:07:29Z2024-03-29T13:07:29ZElectrically stimulated neural stem cells encapsulated in gellan gum hydrogel for spinal cord injury repairArmada, Miguel João Loureiro Afonso da Rochahttps://hdl.handle.net/1822/888412024-02-19T15:31:42Z2024-02-19T15:31:42ZTítulo: Electrically stimulated neural stem cells encapsulated in gellan gum hydrogel for spinal cord injury repair
Autor: Armada, Miguel João Loureiro Afonso da Rocha
Resumo: As lesões da medula espinal podem ter um impacto dramático na vida de um individuo, resultando
em incapacidades motoras, sensoriais, psicológicas e sociais. A patofisiologia das lesões da medula
espinal é extremamente complexa com vários eventos moleculares e celulares a ocorrerem após a lesão
e contribuindo para o desenvolvimento de um microambiente inibitório à regeneração tecidular, o que
dificulta o desenvolvimento de terapias eficazes. Neste contexto, terapias que combinam diferentes
estratégias têm a vantagem de moderar diferentes eventos críticos após este tipo de lesões. Vários tipos
de células têm sido transplantadas de forma a substituir o tecido perdido após lesão. As células mais
promissoras são as Células Estaminais Neuronais induzidas (iNSCs), pois permitem transplantes
autologos e têm a capacidade de se diferenciarem em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Para
promover a sobrevivência das células transplantadas, biomateriais têm sido utilizados para funcionar
como uma matriz extracelular artificial. Adicionalmente, a modulação do ambiente inibitório e por
consequente o sucesso do transplante pode ser melhorado através da suplementação com secretoma
de células mesenquimais estaminais (MSCs). Por fim, a estimulação eléctrica epidural tem-se revelado
como uma terapia muito promissora em pessoas com lesões medulares. Neste projecto propõem-se
uma terapia mais holística, que tem em conta vários eventos patofisiológicos da lesão ao invés do foco
em apenas um. Desta forma, pretende-se alcançar uma terapia eficaz que combina, simultaneamente,
células estaminais, biomaterias, secretoma e estimulação epidural.; Spinal Cord Injuries (SCI) can have a devastating impact on an individual’s life, leadind to motor,
sensory, psychological and social impairments. The SCI pathophysiology associated is extremely
complex, with numerous molecular and cellular events occurring after the initial trauma and that lead to
the development of an inhibitory microenvironment in the injury site, which impairs the development of
new therapies. Therefore, therapies that combine different strategies have been on the rise for focusing
on different critical events. For instance, several types of cells have been implanted in order to replace
lost tissue after these types of lesions. Induced Neural Stem Cells (iNSCs) have been the most promising
for autologous transplant and differentiation in neurons, astrocytes and oligodendrocytes. To promote
the survival of transplanted cells, biomaterials have been implemented to act as an artificial extracelullar
matrix. Additionally, some pathological events and, as a consequence, the success of the transplanted
cells, can be enhanced using the secretome of mesenchymal stem cells (MSCs). At last, epidural
electrical stimulation has revealed to be a promising therapy for SCI, enabling physical rehabilitation and
promoting neural plasticity. Therefore, this project aims to combine all this approaches in order to target
several pathophysiolgical events of the spinal cord injury, instead of just one. As a result, we perform in
vitro studies on the combination of stem cells, biomaterials, secretome and epidural electrical
stimulation in order to obtain an effective therapy.
Descrição: Dissertação de mestrado em Biomedical Engineering, Biomaterials, Rehabilitation and Biomechanics
<b>Tipo</b>: masterThesis2024-02-19T15:31:42ZNovel phenotypic features of the malaria parasite through time-domain nuclear magnetic resonanceEsho, Ruth Victoriahttps://hdl.handle.net/1822/844252023-05-11T17:40:59ZTítulo: Novel phenotypic features of the malaria parasite through time-domain nuclear magnetic resonance
Autor: Esho, Ruth Victoria
Resumo: As infeções de malária continuam a ser um flagelo em regiões endémicas de todo o mundo, atrasando o
crescimento económico e reduzindo a esperança de vida das crianças. O caminho para o controlo e
eliminação da malária tem sido dificultado pela resistência aos medicamentos e ferramentas de diagnóstico
ineficazes para detetar infeções de baixa densidade e assintomáticas. Com a carteira limitada de
medicamentos disponíveis para tratar a malária, é fundamental melhorar a compreensão dos mecanismos
de resistência e avaliar a biologia e patogénese das células parasitárias. Nesta dissertação, visamos explorar
a tecnologia espectroscópica de Ressonância Magnética Nuclear de baixo campo (RMN), juntamente com
abordagens genéticas inversas para estudar a haemozoin, um biomarcador natural de parasitas da malária
com propriedades magnéticas únicas e cuja via biológica para a sua formação, está de alguma forma
relacionada com a maioria dos medicamentos antimaláricos conhecidos.
Caracterizámos o parasita em diferentes fases morfológicas utilizando a RMN de baixo campo para definir as
interações paramagnéticas e a dinâmica de troca de estirpes resistentes a parasitas. A partir destas
medições, caracterizámos com sucesso todo o ciclo intra eritrócito do parasita Plasmodium falciparum,
ligando alguns padrões de RMN de domínio temporal a alterações fisiológicas específicas, tais como os
parasitas específicos de ponto temporal que se deslocam para uma nova fase de desenvolvimento. Para
explorar a capacidade de detetar características distintas de RMN relacionadados com perturbações na via
de desintoxicação da hemoglobina, concentrámo-nos no estudo do PfMDR2, um transportador de metais
pesados e nas plasmepsinas, protéases aspárticas que degradam a hemoglobina dentro do vacúolo alimentar
do parasita. Concebemos uma estratégia para o KO pfmdr2 na estirpe P. falciparum Dd2 e realizámos um
ensaio de fracionamento da hemoglobina em parasitas geneticamente modificados, sobre expressores de
plasmepsinas.
Os dados de RMN de baixo campo obtidas a partir deste estudo foram capazes de distinguir as fases de
parasitas e parasitemia tão baixo quanto 0,01% e revelaram um elevado potencial para explorar ainda mais
o equilíbrio magnético entre espécies de hemorragia e a sua possível correlação com a suscetibilidade dos
parasitas aos fármacos. São necessários estudos futuros para explorar melhor o papel deste transportador e
das enzimas no equilíbrio das espécies de hemorragia e a sua capacidade de fornecer impressões digitais
fenotípicas distintas de NMR. Dadas as características de portabilidade de um dispositivo de RMN de baixo
campo, a captura de dados específicos de RMN poderia fornecer um protótipo para a potencial distribuição
de medicamentos com precisão contra a malária no futuro, aos pacientes.; Malaria infections remain a scourge in endemic regions worldwide, stalling economic growth and reducing life
expectancyin children. The path towards malaria control and elimination has been hindered by drug resistance
and ineffective diagnostic tools to detect low density and asymptomatic infections. With the limited portfolio of
drugs available to treat malaria, it is fundamental to improve the understanding of resistance mechanisms
and appraise parasite cell biology and pathogenesis. In this dissertation, we aimed to exploit low-field Nuclear
Magnetic Resonance (NMR) spectroscopic technology, along with reverse genetics approaches to study
hemozoin, a natural malaria parasite biomarker with unique magnetic properties and which biological pathway
to its formation, is somehow related with most of the known antimalarial drugs.
We have characterized the parasite at different morphological stages using low-field NMR in order to define
the paramagnetic interactions and the exchange dynamics of parasite-resistant strains. From these
measurements, we successfully characterized the entire intraerythrocytic cycle of the Plasmodium
falciparum parasite linking some behavioral time-domain NMR patterns to specific physiological changes such
as the specific time-point parasites move to a new stage development. To explore the capability of detecting
distinct NMR features related with disturbance in haem detoxification pathway, we focused on the study of
PfMDR2, a heavy metal transporter and on plasmepsins, aspartic proteases that degrade haemoglobin inside
the parasite food vacuole. We designed a strategy to KO pfmdr2 into P. falciparum Dd2 strain and performed
a haem fractionation assay on previously genetic engineered parasites over-expressing plasmepsins.
The low-field NMR fingerprints obtained from this study was capable to distinguish parasite stage and
parasitaemia as low as 0.01% and revealed high potential to further exploit the magnetic balance between
haem species and its possible correlation with parasite susceptibility to drugs. Future studies are needed to
explore better the role of this transporter and enzymes in the balance of the haem species and their ability to
deliver distinct phenotypic NMR fingerprints. Given the portability characteristics of a low-field NMR device,
the capture of specific NMR fingerprint could provide a proof-of-concept towards potential delivery of future
precision malaria medicine, at the patients side.
Descrição: Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde
<b>Tipo</b>: masterThesisClosed-loop system for real-time compulsive behavior detection and optogenetic stimulation in obsessive-compulsive disorderSilva, Ana Patrícia Costa dahttps://hdl.handle.net/1822/838912023-04-11T13:02:30ZTítulo: Closed-loop system for real-time compulsive behavior detection and optogenetic stimulation in obsessive-compulsive disorder
Autor: Silva, Ana Patrícia Costa da
Resumo: A perturbação obsessivo-compulsiva (POC) é uma perturbação neuropsiquiátrica
prevalente caracterizada por pensamentos intrusivos recorrentes (obsessões) que podem levar a
comportamentos repetitivos (compulsões), que podem causar perturbações significativas no
quotidiano. Para estudar simultaneamente os circuitos neuronais envolvidos na POC e testar novas
terapias num ambiente pré-clínico, é fundamental desenvolver metodologias que possam
automaticamente detetar e/ou prever o comportamento compulsivo e permitir uma modulação
eficaz dos circuitos cerebrais relevantes com precisão temporal. Assim, desenvolvemos um
sistema de circuito fechado que combina a visão por computador e aprendizagem por máquina
para a deteção eficaz em tempo real de comportamentos compulsivos no modelo de ratinho
Sapap3 KO da POC, com um estimulador cerebral optogenético controlado sem fios. A deteção
exata em tempo real comportamentos repetitivos, tais como o face groom, foi conseguida através
da combinação do DeepLabCut para o rastreio em tempo real de partes do corpo animal com a
extração supervisionada de características comportamentais cinemáticas e classificação de
estados comportamentais com árvores de decisão e Máquinas Vectoriais de Apoio (SVM). A maior
sensibilidade e especificidade de classificação foram alcançadas com árvores de decisão, com
85.1% e 98.3%, respetivamente. Foi também desenvolvido e programado um estimulador cerebral
ótico alimentado por bateria numa PCB leve (1.43 g) com comunicação Bluetooth de Baixa Energia
(BLE). A deteção online de comportamento repetitivo desencadeia o transmissor BLE a enviar um
pedido de escrita, com uma latência inferior a 6.67 ms. O sistema completo de ciclo fechado
atinge uma latência mínima de apenas 29.9 ms entre o momento em que um sinal BLE é enviado,
e o estimulador cerebral ótico responde com parâmetros de estimulação definidos pelo utilizador.
Este novo sistema de circuito fechado permite uma avaliação direta do impacto das manipulações
dos circuitos cerebrais no comportamento compulsivo, contribuindo para a elucidação dos
circuitos cerebrais envolvidos na POC e para o desenvolvimento de novas terapias.; Obsessive-compulsive disorder (OCD) is a prevalent neuropsychiatric disorder
characterized by recurrent intrusive thoughts (obsessions) that can lead to repetitive behaviors
(compulsions), which can cause significant disruption of daily activities. To simultaneously study
the neuronal circuits involved in OCD and test novel therapies in a pre-clinical setting, it is critical
to develop methodologies that can automatically detect and/or predict compulsive behavior and
allow effective modulation of relevant brain circuits with temporal precision. Thus, we developed a
closed-loop system that combines computer vision and machine learning approaches for effective
real-time detection of compulsive/repetitive behaviors in the Sapap3 KO mouse model of OCD,
with a wirelessly controlled optogenetic brain stimulator. Accurate online detection of repetitive
behavioral motifs, such as face grooming, was achieved by combining DeepLabCut for real-time
animal body part tracking with supervised extraction of kinematic behavioral features and
classification of behavioral states with Decisions trees and Support Vector Machines (SVM). The
highest classification sensitivity and specificity were achieved with decision trees, with 85.1% and
98.3%, respectively. A battery-powered optical brain stimulator in a lightweight PCB (1.43 g) with
Bluetooth Low Energy (BLE) communication was also developed and programmed. Online
detection of repetitive behavior triggers the BLE transmitter to send a writing request, with a latency
inferior to 6.67 ms. The complete closed-loop system achieves a minimum latency of only 29.9
ms between the moment a BLE signal is sent, and the optical brain stimulator responds with user defined stimulation parameters. This new closed-loop system allows a direct assessment of the
impact of brain circuit manipulations in compulsive behavior, contributing to the elucidation of the
brain circuits involved in OCD and novel therapies developments.
Descrição: Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica
<b>Tipo</b>: masterThesisUnravelling the role of the spinocerebellar ataxia type 3-associated protein ATXN3 in glioblastomaSousa, Ana Margarida Machadohttps://hdl.handle.net/1822/836862023-03-31T08:56:52Z2023-03-31T08:56:51ZTítulo: Unravelling the role of the spinocerebellar ataxia type 3-associated protein ATXN3 in glioblastoma
Autor: Sousa, Ana Margarida Machado
Resumo: O glioblastoma (GBM) é o tipo de glioma mais comum e maligno em adultos. Apesar dos esforços
para investigar diversos tratamentos, os pacientes com GBM apresentam uma evolução clínica rápida e
desfavorável, com uma sobrevida mediana de apenas 15 meses após o diagnóstico. Para além disso, a
elevada atividade proliferativa e a natureza heterogénea e complexa do GBM estão associadas a um
resultado clínico imprevisível e diverso. Assim, a identificação de marcadores moleculares de prognóstico
que permitam a categorização de subgrupos de pacientes com GBM é fundamental para contribuir para
a melhoria do seu resultado clínico. A ataxina-3 (ATXN3), a proteína envolvida na doença
neurodegenerativa Ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3), é uma proteína conservada evolutivamente e
expressa de forma ubíqua, que foi proposta como sendo uma enzima desubiquitinase. Além do seu
envolvimento em SCA3, foi sugerido que a ATXN3 desempenha um papel em cancro, desempenhando
funções oncogénicas ou supressoras tumorais dependendo do tipo tumoral. Uma vez que nenhum
estudo, até ao momento, explorou o potencial envolvimento da ATXN3 em gliomas, e, particularmente
em GBM, neste trabalho pretendemos, pela primeira vez, avaliar o papel funcional da ATXN3 em GBM e
a sua relevância clínica nesta doença.
Observámos que a expressão da ATXN3 diminui significativamente nos graus mais elevados de
glioma, sendo menos expressa em GBM quando comparada com gliomas de baixo grau. Adicionalmente
demonstrámos que a expressão da ATXN3 está associada à mutação de IDH e à codeleção 1p/19q. Em
células de GBM, observámos que a ATXN3 é expressa em todos os modelos testados, ao nível de RNAm
e ao nível da proteína. Funcionalmente, a sobre-expressão da ATXN3 foi associada a uma diminuição
significativa da viabilidade celular e da invasão em modelos in vitro de GBM. No entanto, em relação à
proliferação e à migração celular não foi detetado um efeito estatisticamente significativo nos mesmos
modelos. Estes dados sugerem que a ATXN3 pode ter funções de gene supressor tumoral em GBM,
diminuindo a agressividade destes gliomas in vitro. Em pacientes com GBM, descobrimos que a ATXN3
tem valor de prognóstico clínico, estando associada a uma sobrevida global mais longa,
independentemente de outros potenciais fatores de prognóstico.
Em suma, este trabalho permitiu que se compreendesse o papel da ATXN3 em GBM ao identificá la como um gene supressor tumoral, e como um novo biomarcador de prognóstico favorável, trazendo
novos conhecimentos sobre os mecanismos moleculares subjacentes a esta doença mortal.; Glioblastoma (GBM) is the most common and malignant type of glioma in adults. Despite the efforts
to investigate various treatments, GBM patients exhibit a rapid and unfavorable clinical evolution, with a
median overall survival of only 15 months after diagnosis. Furthermore, the high proliferative activity, and
heterogeneous and complex nature of GBM is associated with an unpredictable and distinct clinical
outcome. Thus, the identification of molecular prognostic markers that allow the categorization of
subgroups of patients with GBM is critical to contribute to the improvement of their clinical outcome.
Ataxin-3 (ATXN3), the protein involved in the neurodegenerative disease Spinocerebellar Ataxia Type 3
(SCA3), is an evolutionarily conserved and ubiquitously expressed protein, which has been proposed to
act as a deubiquitinating enzyme. In addition to its involvement in SCA3, ATXN3 was suggested to play a
role in cancer, performing oncogenic or tumor suppressive functions depending on the tumor type. Since
no study to date has explored the potential involvement of ATXN3 in gliomas, and particularly in GBM, in
this work we intend, for the first time, to evaluate the functional role of ATXN3 in GBM and the clinical
relevance of this protein in this deadly disease.
We observed that ATXN3 expression decreases significantly with glioma grade, being less
expressed in GBM when compared to lower-grade gliomas, and that it is associated with IDH mutation
and 1p/19q codeletion. Specifically in GBM cells, we observed that ATXN3 is expressed in all cell models
tested, both at the mRNA and protein level. Functionally, ATXN3 overexpression was associated with a
significant decrease in the cell viability and invasion of GBM in vitro models, although no statistically
significant effect was observed regarding cell proliferation and migration. This data suggests that ATXN3
may have tumor suppressive functions in GBM, decreasing its aggressiveness in vitro. In GBM patients,
we found that ATXN3 has clinical prognostic value, being associated with longer overall survival,
independently of other potential prognostic factors.
In summary, this work allowed the understanding of the role of ATXN3 in GBM by identifying it as
a tumor suppressor gene, and as a new prognostic biomarker of favorable outcome, bringing new
knowledge about the molecular mechanisms underlying this deadly disease.
Descrição: Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde
<b>Tipo</b>: masterThesis2023-03-31T08:56:51ZGraphene field-effect transistors functionalization for neurotransmitter biosensingAbrantes, Mafalda Inês Gonçalves dehttps://hdl.handle.net/1822/831212023-03-24T14:12:34ZTítulo: Graphene field-effect transistors functionalization for neurotransmitter biosensing
Autor: Abrantes, Mafalda Inês Gonçalves de
Resumo: A compreensão de como o cérebro funciona é fundamental para o desenvolvimento de novos
métodos de diagnóstico e terapêutica para as doenças que afetam o cérebro. O grafeno, devido às usas
propriedades únicas, tem sido exponencialmente utilizado para novas aplicações biomédicas e é um
material emergente para biossensores, incluindo no cérebro.
A dopamina é um neurotransmissor, a mensagem química produzida pelas células no cérebro,
envolvida em várias funções críticas como o controlo motor e a aprendizagem. Logo, alteração dos níveis
de dopamina está relacionada com várias doenças que afetam o cérebro, incluindo Doença de Parkinson,
esquizofrenia e abuso de substâncias. De forma a obter um método de deteção para dopamina mais
seletivo e sensível, neste trabalho foi desenvolvido um novo sensor bio eletrónico.
O canal de grafeno mono-camada de transístores de efeito de campo de porta líquida foi
funcionalizado com uma sonda, o aptâmero de DNA específico para a dopamina. Quando o aptâmero se
liga à dopamina, a redistribuição da carga eletrónica na superfície do grafeno gera uma mudança no
campo elétrico que altera a condutividade eletrónica no canal e a resposta geral do dispositivo. Seguindo
as alterações da condutividade com a adição de concentrações conhecidas de dopamina, definição das
curvas de calibração dos sensores foi possível. Para tal, experiências de deteção de dopamina foram
realizadas in vitro em solução salina de fosfato tampão e em líquido cefalorraquidiano artificial. No
primeiro foi obtido um limite de deteção de 1 aM, o mais baixo reportado para um sensor de dopamina
e no segundo o limite foi de 10 aM. A seletividade dos sensores também foi testada comparando as
respostas da dopamina aos seus percursores, como L-Dopa e L-Tirosina, e a agentes interferentes como
ácido ascórbico. O uso de um aptâmero específico para dopamina permitiu uma excelente seletividade,
pois a resposta dos sensores a outras moléculas foi negligenciável. A excelente seletividade e
sensibilidade dos nossos sensores permitiram também a realização de experiências ex vivo com
amostras extraídas de murganhos. Os nossos sensores foram utilizados para demonstrar que a
reserpina, uma droga que exauria a dopamina das sinapses neuronais, foi eficiente na redução do
conteúdo de dopamina no líquido cefalorraquidiano de murganhos injetados com reserpina em 5 vezes
quando comparado controlos. Foi também confirmada a habilidade dos nossos sensores em detetarem
dopamina em meios complexos, através da adição de concentrações de dopamina artificial a
homogeneizado de cérebro de murganhos tratados, tendo sido obtido um limite de deteção de 0.1 fM.
Os resultados inovadores permitem-nos considerar experiências futuras num ambiente in vivo.; The understanding of how the brain works is fundamental for the development of new diagnostic
and therapeutic methodologies for brain disorders. Graphene, due to its unique properties, is being
increasingly used in a wide range of novel biomedical applications and is an emerging material for
biosensing, including in the brain.
Dopamine is a critical neurotransmitter, the chemical messages produced by brain cells, is
dopamine, which is involved in various functions from motor control to learning. Thus, dopamine
dysfunction underlies several brain disorders, including Parkinson’s Disease, schizophrenia and
substance abuse. Striving to obtain a more sensitive and selective method of detection for dopamine, we
engineered a new bioelectronic sensor for dopamine detection in this work.
Electrolyte-gated graphene field-effect transistors’ monolayer graphene channel was
functionalized with a molecular linker and a probe, a dopamine-specific DNA aptamer. When this receptor
binds with dopamine, the redistribution of electronic charges on the graphene surface generates a change
in the electric field which alters the electronic conductivity in the channel and overall device response. By
tracking the changes in conductivity with the addition of known concentrations of dopamine calibration
curves for our sensors were established. To do so, dopamine detection experiments were carried out in
vitro in phosphate buffered saline solution and artificial cerebrospinal fluid electrolytic solutions. In PBS
the obtained limit of detection (LOD) was of 1 aM, the lowest ever reported for a dopamine sensor, while
in aCSF the LOD was of 10 aM. The sensors selectivity was also tested by comparing responses to
dopamine with responses to dopamine precursors such as L-DOPA and L-tyrosine, and biological
interferents as ascorbic acid. The use of a dopamine specific-aptamer allowed an outstanding selectivity,
with the sensors producing negligeable responses to the other tested molecules. The excellent selectivity
and sensitivity of our sensors allowed us the performance of ex vivo experiments with samples extracted
from mice. Our novel sensors were used to show that reserpine, a drug that can deplete dopamine from
brain synapses, was effective in reducing dopamine content in cerebrospinal fluid (CSF) extracted from
reserpine injected mice by 5-fold compared with controls. Taking advantage of brain homogenate samples
that were depleted of dopamine by the action of reserpine, the ability of our sensors to perform detection
in such a complex media was confirmed by adding known concentrations of dopamine to these samples.
Although an expected loss of sensitivity was observed, the LOD in these complex samples was of 0.1 fM.
These ground-breaking results allow us to consider further experiments in an in vivo setting.
Descrição: Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Física (especialização em Dispositivos, Microssistemas e Nanotecnologias)
<b>Tipo</b>: masterThesis