Expression and production of recombinant frutalin in different expression systems and evaluation of its biomedical applications

Abstract

Frutalin is the α-D-galactose-binding jacalin-related lectin expressed in breadfruit seeds (Artocarpus incisa). This lectin may be used in cancer diagnostics/therapeutics, taking advantage of its potential ability to recognise specific carbohydrates expressed in cancer cells membranes and/or cells surface receptors. Preliminary immunohistochemical studies have suggested that frutalin might be used as a diagnostic biomarker of breast and thyroid cancer. These applications require large amounts of frutalin with a high level of purity. However, the extraction of frutalin from plant seeds has several disadvantages, as it is a time-consuming process, with relative low yields, and typically results in a heterogeneous mixture of different natural isoforms. Frutalin isoforms may have different biological properties leading to undesired results variability when applied in cancer diagnosis and therapy. One way to overcome these limitations is the recombinant expression and production of frutalin. Therefore, in this work frutalin was cloned and expressed in three different expression systems, namely Pichia pastoris (yeast), Escherichia coli (bacteria) and insect cells/baculovirus system (Sf9 cell line). Moreover, the potential application of native and recombinant frutalin in cancer diagnosis and therapy was studied and compared. To date, the molecular cloning and expression of frutalin, as well as its use in cancer diagnostics/therapeutics research, has never been reported. A cDNA library was constructed with A. incisa RNA using synthetic oligonucleotides based on an amino-acid sequence of mature frutalin. The screening of the library yielded multiple positive clones encoding frutalin, suggesting that it may be encoded by a family of genes, which corroborates the presence of different frutalin isoforms in breadfruit seeds. In addition, the deduced frutalin amino-acid sequences presented high identity with sequences of other galactosebinding lectins of Moraceae family.

One of the cDNA sequences obtained was sub-cloned, for recombinant frutalin expression, in the E. coli and insect cells/baculovirus expression systems. For the P. pastoris system, an optimised frutalin synthetic gene based on the frutalin mature protein sequence was cloned. Recombinant frutalin was detected in supernatants of recombinant P. pastoris cultures and in cellfree extracts of recombinant E. coli and infected insect cells by SDS-PAGE and/or Western blot analysis. Molecular and biological differences were found between each recombinant frutalin obtained and native frutalin. Frutalin was expressed in the three expression systems as a single chain protein, since the four amino-acid linker “T-S-S-N“, which connects α and β chains, was not cleaved. In native frutalin processing, this linker is excised to separate α and β chains, forming a tetrameric protein in which each monomer is made of one α chain and one β chain bound by noncovalent linkages. None of the three recombinant lectins obtained was able to bind Adenanthera pavonina galactomannan, as described for native frutalin, thus alternative purification strategies were adopted. This result indicated differences in carbohydrate-binding affinity between recombinant lectins and native frutalin.

Optimisation of recombinant frutalin expression and purification was conducted for the P. pastoris and E. coli systems. In Pichia, approximately 18-20 mg of secreted recombinant frutalin per litre of medium was obtained from a typical small scale methanol-induced culture purified by size-exclusion chromatography. In E. coli, 16 mg/l of soluble recombinant frutalin was obtained by implementing an experimental factorial design to maximise protein expression. The purification of the recombinant frutalin from the E. coli cell-free extracts by size-exclusion chromatography followed by ion-exchange chromatography was estimated to lead up to 76 µg of recombinant lectin per litre of E. coli culture. Therefore, the yield of pure recombinant frutalin obtained in E. coli was very low, compared to that obtained in P. pastoris. Recombinant frutalin produced in P. pastoris revealed a carbohydrate-binding specificity similar to that reported for the breadfruit lectin; however, it presented lower affinity. This result shows that linker cleavage might not be essential for lectin sugar-binding specificity but may be needed to achieve higher affinity. Recombinant yeast frutalin is a partly N-glycosylated lectin and possibly has a tetrameric structure, similar to native frutalin; nevertheless it did not agglutinate rabbit erythrocytes as native lectin does. On the other hand, recombinant frutalin expressed in E. coli presented hemagglutinating activity but, as expected, the recombinant frutalin is not glycosylated. This result indicates that the P. pastoris glycosylation pattern may inhibit the hemagglutinating activity, since the presence of the linker in recombinant frutalin expressed in E. coli did not inhibit its agglutinating activity. Nevertheless, cell-free extracts of infected insect cells, containing unglycosylated recombinant frutalin, did not present hemagglutinating activity. The hemagglutinating activity of recombinant frutalin expressed in E. coli was inhibited by sugars containing galactose, as occurred with the native lectin. Thus, this recombinant frutalin presents sugar-binding specificity identical to that of native frutalin. As native frutalin, recombinant frutalin produced in P. pastoris demonstrated a considerable potential for biomedical applications. It was able to recognise human tumour cells in immunohistochemical studies conducted with prostate tissues removed from patients by surgery. Moreover, it showed higher ability than native frutalin to differentiate malign from benign prostate diseases. Therefore, recombinant yeast frutalin may be potentially used as a biomarker of prostate cancer. In addition, this recombinant lectin showed identical strong cytotoxicity to that performed by native frutalin on the proliferation of human cancer cells in vitro (cell lines originated from breast and cervical cancer). This result suggests that recombinant frutalin may be studied as a potential anti-cancer agent, in alternative to native frutalin.

A frutalina é a lectina α-D-galactose-ligante jacalina-relacionada expressa nas sementes da fruta-pão (Artocarpus incisa). Esta lectina pode ser usada no diagnóstico e terapia do cancro, tirando partido da sua potencial capacidade de reconhecimento de carbohidratos específicos expressos nas membranas das células cancerígenas e/ou de receptores nas superfícies das mesmas. Estudos preliminares de imunohistoquímica sugerem que a frutalina poderá ser usada como bio-marcador tumoral do cancro da mama e tiróide. Estas aplicações requerem grandes quantidades de frutalina com elevado grau de pureza. No entanto, a extracção da frutalina das sementes de planta apresenta várias desvantagens, sendo um processo longo, de rendimentos relativamente baixos, e tipicamente resulta numa mistura heterogénea de diferentes isoformas naturais. Estas isoformas podem ter diferentes propriedades biológicas levando a uma indesejável variabilidade de resultados quando aplicadas no diagnóstico e terapia do cancro. Uma forma de ultrapassar estas limitações é a expressão e purificação recombinante da frutalina. Como tal, neste trabalho a frutalina foi clonada e expressa em três sistemas de expressão diferentes, nomeadamente em Pichia pastoris (levedura), Escherichia coli (bactéria) e células de insecto/baculovírus (linha celular Sf9). A potencial aplicação da frutalina nativa e da frutalina recombinante no diagnóstico e terapia do cancro foi ainda estudada e comparada. Até à presente data, a clonagem e expressão da frutalina, assim como o seu uso em investigação para diagnóstico e terapia do cancro, nunca foi descrita.

Uma biblioteca de cADN foi construída com o ARN de A. incisa usando oligonucleotídeos sintéticos baseados numa sequência de aminoácidos da frutalina madura. A análise desta biblioteca revelou múltiplos clones positivos codificando a frutalina, o que sugere que esta pode ser codificada por uma família de genes e corrobora a presença de diferentes isoformas da frutalina nas sementes da fruta-pão. Para além disso, as sequências de aminoácidos deduzidas apresentaram uma elevada identidade com as sequências de outras lectinas galactose-ligantes da família Moraceae.

Uma das sequências de cADN obtidas foi sub-clonada, para expressão recombinante da frutalina, nos sistemas de expressão de E. coli e células de insecto/baculovírus. No sistema de P. pastoris foi clonado um gene sintético optimizado baseado numa sequência proteica da frutalina madura. A frutalina recombinante foi detectada por SDS-PAGE e/ou Western blot nos sobrenadantes de culturas de P. pastoris recombinante e em extractos proteicos de E. coli recombinante e de células de insecto infectadas. A frutalina foi expressa nos três sistemas de expressão como uma proteína de cadeia única, uma vez que o linker de quatro aminoácidos “T-SS-N”, que liga as cadeias α e β, não foi clivado. No processamento da frutalina nativa este linker é removido para separar as cadeias α e β, formando uma proteína tetramérica na qual cada monómero é constituído por uma cadeia α e uma cadeia β unidas por ligações não covalentes.

Nenhuma das três lectinas recombinantes obtidas foi capaz de se ligar à galactomanana de Adenanthera pavonina, tal como descrito para a frutalina nativa, pelo que foram adoptadas estratégias de purificação alternativas. Este resultado indicou diferenças na afinidade de ligação a carbohidratos entre as lectinas recombinantes e a frutalina nativa.

A optimização da expressão e purificação da frutalina recombinante foi realizada para os sistemas de P. pastoris e E. coli. Em P. pastoris, aproximadamente 18-20 mg de frutalina recombinante por litro de meio foi obtida a partir de uma cultura típica em pequena escala, induzida com metanol e purificada por cromatografia de exclusão de peso molecular. Em E. coli, 16 mg/l de frutalina recombinante solúvel foi obtida implementando um desenho factorial de experiências para maximizar a expressão de proteína. A purificação da frutalina recombinante dos extractos proteicos de E. coli por cromatografia de exclusão de peso molecular seguida de cromatografia de troca iónica originou no máximo 76 µg de lectina recombinante por litro de cultura de E coli. Desta forma, o rendimento de frutalina recombinante pura obtido em E. coli foi muito baixo, comparado com o obtido em P. pastoris.

A frutalina recombinante produzida em P. pastoris revelou uma especificidade de ligação a carbohidratos semelhante ao descrito para a lectina da fruta-pão, no entanto apresentou menor afinidade. Este resultado mostra que a clivagem do linker poderá não ser essencial para a especificidade de ligação a açúcares mas necessária para se atingir maior afinidade. A frutalina recombinante produzida em levedura é parcialmente N-glicosilada e provavelmente tem uma estrutura tetramérica, tal como a frutalina nativa, contudo não aglutinou eritrócitos de coelho. Por outro lado, a frutalina recombinante expressa em E. coli apresentou actividade hemaglutinante mas, tal como esperado, esta não é glicosilada. Este resultado indica que o padrão de glicosilação de P. pastoris pode inibir a actividade hemaglutinante, uma vez que a presença do linker na frutalina recombinante expressa em E. coli não inibiu esta actividade. Contudo, os extractos proteicos de células de insecto infectadas, contendo frutalina recombinante não glicosilada, não apresentaram actividade hemaglutinante. A actividade hemaglutinante da frutalina recombinante expressa em E. coli foi inibida por açúcares contendo galactose, tal como ocorreu com a lectina nativa. Esta frutalina recombinante apresenta assim uma especificidade de ligação a açúcares idêntica à descrita para a frutalina nativa. Tal como a frutalina nativa, a frutalina recombinante produzida em P. pastoris demonstrou uma considerável potencial aplicação biomédica. Esta lectina foi capaz de reconhecer células tumorais humanas em estudos de imunohistoquímica realizados com tecidos da próstata removidos dos pacientes por cirurgia. Para além disso, mostrou maior capacidade do que a frutalina nativa para diferenciar doenças da próstata malignas de benignas. Como tal, a frutalina recombinante produzida em levedura pode ser potencialmente usada como bio-marcador do cancro da próstata. Adicionalmente, quer a frutalina recombinante quer a nativa mostraram uma idêntica forte toxicidade na proliferação de células cancerígenas humanas in vitro (linhas celulares originadas do cancro da mama e do útero). Este resultado sugere que esta frutalina recombinante pode ser estudada como um potencial agente anti-cancerígeno, em alternativa à frutalina nativa.