Characterization of the in vitro cytokine response of phagocytes to mycobacteria

Abstract

Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis, remains one of the main threats to mankind. Despite the intense research on the immune response to tuberculosis, major questions remain unsolved, one of which relates to the fact that the efficacy of the current vaccine, Mycobacterium Bovis BCG, is variable. However, no other experimental vaccines against tuberculosis developed in the last 100 years were proven to be better than BCG. Therefore BCG remains the only vaccine available to date to prevent tuberculosis. A possible explanation for the variability of BCG efficacy relies on the fact that the immune response triggered by BCG and M. tuberculosis is different. Nevertheless, M. tuberculosis-based experimental vaccines tend not to protect better than BCG. We therefore hypothesized that the basic protective response triggered by BCG must be appropriate, although it needs to be improved in order to confer higher and longer lasting protection. In this work, we performed a comparative study of M. tuberculosis versus BCG infection on dendritic cells (DCs) and macrophages to better understand how these pathogens interact with cells of the innate immune system and how that might translate into an effective, or not, T helper (Th) cell response. We found that macrophages and DCs respond differently to M. tuberculosis or BCG stimulation in what concerns cytokine expression. The expression of IL-12p40, TNF and IL-6 is significantly higher in DCs than in macrophages stimulated with either mycobacteria. Nevertheless, the expression of IL-12p35 and IL-10 was similar in both cell types. We also found that the same cell type respond differently to M. tuberculosis or BCG. M. tuberculosis-stimulated DCs induced higher levels of p40 and p19 monomers and of the bioactive cytokines IL-12 and IL-23, respectively. BCGstimulated DCs produced higher amounts of TNF. The amounts of IL-6 and IL-10 secreted upon stimulation of DCs with M. tuberculosis or BCG were similar. The differential expression of IL-12 and IL-23 might be correlated in part to a higher activation of the MAP kinase ERK1/2 in DCs in response to M. tuberculosis than to BCG. Although macrophages were in general poorly induced to produce cytokines, when compared to DCs, the threshold of ERK1/2 activation was higher in stimulated macrophages. A consequence of the differential activation of DCs was reflected on the distinct type of Th responses developed when M. tuberculosis- or BCG-infected DCs presented OVA peptide to TCRtransgenic CD4+ T cells. M. tuberculosis-infected DCs were able to induce the development of both Th1 and Th17 responses, whereas BCG-infected DCs presented a shift towards Th17 responses. These differences are of interest considering the importance of Th1/Th17 balance during vaccination. Further understanding the molecular mechanisms dictating this differential Th response will be used for the development of new vaccines.

A tuberculose é causada pelo Mycobacterium tuberculosis e constitui um grave problema a nível mundial. Apesar de todo o esforço dedicado ao estudo desta infecção, questões como a variabilidade da eficácia da corrente vacina em uso, M. bovis BCG, permanecem inexplicáveis. No entanto, nos últimos 100 anos, não foi experimentalmente desenhada outra vacina mais eficiente do que o BCG. Sendo assim, a única vacina disponível até ao momento para combater a tuberculose é o BCG. Uma possivel explicação para a variabilidade da vacina consiste no facto de o M. tuberculosis e o M. bovis BCG desencadearem uma resposta imunológica diferente.Contudo, vacinas experimentais baseadas no M. tuberculosis não conferem maior protecção do que o BCG. A nossa hipótese, é que a resposta desencadeada pelo BCG deve ser adequada, embora necessite de ser melhorada de modo a conferir uma protecção maior e mais prolongada. Neste trabalho foram comparadas as infecções por M. tuberculosis versus BCG em células dendríticas (DCs) e em macrófagos, com os objectivos de compreender melhor a interacção entre estes agentes patogénicos e o sistema imunológico inato, e como é que isso se traduz, ou não, numa reposta T de ajuda (Th) eficaz. Os nossos resultados mostram que as respostas induzidas pelos macrófagos e pelas DCs estimulados por M. tuberculosis ou por BCG, em termos de expressão de citocinas, são diferentes. A expressão de IL-12p40, TNF e IL-6 induzida por ambas as micobactérias foi significativamente maior em DCs do que em macrófagos. Contudo, a expressão de IL-12p35 e IL-10 foi semelhante em ambos os tipos celulares. Observamos, também, que o mesmo tipo celular responde de modo diferente ao M. tuberculosis ou ao BCG. As DCs estimuladas pelo M. tuberculosis induziram níveis elevados de p40 e p19, bem como das respectivas citocinas bioactivas IL-12 e IL-23. As DCs estimuladas pelo BCG produziram elevados níveis de TNF. A produção de IL-6 e IL-10 foi semelhante quer nas DCs estimuladas pelo M. tuberculosis quer pelo BCG. A expressão diferencial de IL-12 e de IL-23 poderá estar correlacionada, em parte, com uma maior activação da MAP cinase ERK1/2 pelas DCs em resposta ao M. tuberculosis relactivamente ao BCG. Embora a indução de citocinas pelos macrófagos fosse menor do que pelas DCs, o threshold de activação do ERK1/2 induzido pelos macrófagos foi maior. A diferente activação induzida pelo M. tuberculosis ou BCG em DCs reflectiu-se no tipo de resposta Th diferenciada. Em DCs estimuladas com M. tuberculosis ou BCG, que apresentam o péptido OVA a células T CD4+ cujo TCR é transgénico, observamos que as DCs estimuladas com M. tuberculosis induziram o desenvolvimento de respostas Th1 e Th17, enquanto que DCs estimuladas com BCG induziram uma resposta Th17 superior à observada com M. tuberculosis. Considerando a importância do balanço Th1/Th17 durante a vaccinação, as diferenças observadas são de extrema relevância, dado que a compreensão dos mecanismos moleculares que ditam esta resposta diferencial consiste numa estratégia para o desenvolvimento de novas vacinas contra a tuberculose.