Papel da Aquagliceroporina Fps1 na sensibilidade ao Etanol de Saccharomyces cerevisiae, e o efeito do tratamento cruzado com ácido acético

Abstract

A aquaglicerporina Fps1 é um membro da família de proteínas-canal MIP, e um conhecido facilitador do transporte de glicerol. Recentemente foi também apontada como um elemento importante na resistência das leveduras ao ácido acético, num processo que inclui a sua remoção da membrana plsmática, após fosforilação mediada pela Hog1 MAP cinase. Num trabalho anterior verificou-se que células de S. cerevisiae apresentam maior tolerância ao etanol quando o tratamento é feito na presença de pequenas concentrações de ácido acético. Considerando estes dados, propomo-nos a estudar o papel da Fps1 na sensibilidade ao etanol de S. cerevisaie, e a avaliar de que forma o ácido acético pode contribuir para a maior resistência das células de levedura. Numa primeira abordagem tentou-se avaliar a tolerância ao etanol de estirpes transformadas de S. cerevisaie expressando uma proteína Fps1 normal (wt), deficiente no gene FPS1 (fps1Δ), ou com um canal contitutivamente aberto (Fps1-Δ1). Os dados foram obtidos por contagem de u.f.c. e pela detecção da marcação com IP, por citometria de fluxo, e revelaram que tanto a estirpe fps1Δ como a Fps1-Δ1 são mais tolerantes que a estirpe wt, em meio SCglucose. Nos ensaios em YPd, no entanto, fps1Δ e Fps1-Δ1 revelaram-se menos tolerantes que a wt. Testou-se também o efeito do ácido acético na tolerância ao etanol das estirpes fps1Δ e wt. Em meio SC-glucose, o ácido acético protegeu ambas as estirpes da morte-induzida por etanol, com maior efeito em fps1Δ. Já em YPD, o ácido acético potenciou a morte induzida por etanol em ambas as estirpes. No seu conjunto estes dados indicam que a maior tolerância de fps1Δ ao etanol é independente da difusão do etanol através da Fps1p, reflectindo provavelmente uma efeito mutacional pleiotrópico. Este fenótipo parece depender da manipulação das estirpes e do meio de cultura usado. A possibilidade da Hog1p activada pelo ácido poder estar envolvida nesta protecção foi também estudada. Os dados revelaram que o efeito de protecção é independente da hog1p. Utilizando uma proteína Fps1-GFP testou-se a hipótese do etanol, tal como ácido acético, poder também induzir a remoção da Fps1p da membrana plasmática e a sua subsequente degradação no vacúolo. Estes testes, no entanto, não foram conclusivos, uma vez que a Fps1-GFP utilizada não foi removida da membrana de células tratadas com 100 mM de ácido acético, como descrito num trabalho anterior. Saccharomyces cerevisiae é um organismo intensamente estudado, tanto como modelo eucariota como pela sua importância para as actividades humanas. O desenvolvimento de estirpes de levedura com elevada tolerância ao etanol seria assim bastante interessante do ponto de vista biotecnológico. Este estudo sugere que o tratamento com ácido acético pode conferir maior tolerância a células de levedura expostas ao etanol. Outros ensaios são ainda necessários para perceber se a Fps1 é capaz de induzir respostas celulares importantes para a resistência das células, e qual o seu papel na sobrevivência das leveduras ao stress por etanol

The Fps1 aquaglyceroporin is a yeast member of the MIP family of channel proteins that has been well described as a glycerol facilitator. Recently, it has also been appointed as an important element in acetic acid resistance of yeast cells; a process that involves Fps1 removal after phosphorylation by the Hog1 MAP kinase. A previous work demonstrated that Saccharomyces cerevisiae cells presented higher ethanol tolerance when simultaneously treated with low concentrations of acetic acid. Considering this evidence, we proposed to study the effect of Fps1 in the ethanol sensitivity of S. cerevisiae, and to understand how acetic acid may contribute to an increased resistance of yeast cells to ethanol. Our first approach aimed to evaluate the ethanol tolerance of different transformed S. cerevisiae strains expressing a normal Fps1 protein (wt), disrupted on the FPS1 gene (fps1Δ) or with a constitutively open form (Fps1-Δ1). All data were obtained by both c.f.u. counting and PI staining measurements by flow cytometry, and showed that both the fps1Δ and the Fps1-Δ1 strains are more tolerant to ethanol than the wt strain, in SC-glucose medium. However, when tested in YPD, both fps1Δ and the Fps1-Δ1 strains were less tolerant than the wt. We then tested the effect of acetic acid on the ethanol tolerance of wt and fps1Δ strain, in SC-glucose culture medium. Acetic acid protected both strains from ethanol-induced death though more markedly for the fps1Δ strain. In contrast, in YPD acetic acid enhanced ethanol-induced death in both strains, particularly in the fps1Δ. When non transformed wt and fps1Δ strains were used the ethanol tolerance was similar for both strains. Together the results indicate that the higher fps1Δ tolerance to ethanol is independent of ethanol diffusion through Fps1p and most likely reflects a mutation pleiotropic effect. Moreover, such phenotype depends on strain manipulations and culture medium used. The possibility of acetic acid-activated Hog1p could be involved in the cross protection of acetic acid against ethanol was evaluated. The results showed that the observed protection effect was independent of Hog1p. Using a C-terminally GFP tagged Fps1; we tested if ethanol, like acetic acid, could induce Fps1 removal from the plasma membrane and its subsequent degradation in the vacuole. These tests, however, were not conclusive since theFps1-GFP used was not removed from the plasma membrane of cells treated with 100 mM acetic acid, as described in a previous work. S. cerevisiae is an intensively studied organism, either as a eukaryotic model, or due to its importance concerning numerous human activities. The development of S. cerevisiae strains with increased tolerance to ethanol represents, therefore, a potentially interesting application in biotechnology. The present work suggests that treatment with acetic acid renders cells more tolerant when exposed to ethanol. Still, further studies are necessary to find out if Fps1 could induce cellular changes relevant for the mechanism of cell resistance, and to understand the exact role of Fps1 in yeast survival under ethanol stress.