Bacterial cellulose: studies on biocompatibility, surface modification and interaction with cells

Abstract

A wide variety of biomaterials and bioactive molecules have been applied in tissue engineering as scaffolds in order to provide an appropriate environment to the growth and differentiation of cells. However, creating devices for biological substitutes that enhance the regeneration of neural tissues is still a challenge, because of the difficulty in providing an active stimulation of nerve regeneration. Biological scaffolds can be composed of natural polymers combined with extracellular matrix molecules and have been shown to facilitate the constructive remodeling of many tissues by the establishment of an environment necessary for the regulation of cell processes. In this context, different biomaterials have been used as scaffolds to improve interactions between material/cells and repair neurological damages. In recent years, bacterial cellulose (BC) emerged as a promising biomaterial in tissue engineering due its properties: high crystalinity, wettability, high tensile strength, pure nanofibers network, moldability in situ and simple production. BC has been modified to further enhance cell adhesion and biocompatibility; as an alternative to peptide chemical grafts, BC allow the use of recombinant proteins containing carbohydrates binding domains (CBMs), such as the CBM3, which has affinity by cellulose, representig a attractive way to specifically adsorb bioactive peptides on cellulose surface. The goal of this work was to modify the bacterial cellulose improving the neuronal cell affinity and producing a scaffold with potential to be used in neural tissue engineering. For this purpose, two strategies were used: 1) adhesive peptides fused to a carbohydrate binding domain with affinity to cellulose and; 2) surface modification by nitrogen plasma treatment. Also, in this work, we analized the biocompatibility in a longterm approach of two different types of BC grafts and the effect of BC nanofibers subcutaneously implanted in mice. The recombinant proteins IKVAV-CBM3, exIKVAV-CBM3 and KHIFSDDSSECBM3, were successfully expressed in E. coli, purified and stably adsorbed to the BC membranes. The in vitro results showed that the exIKVAV-CBM3 was able to improve the adhesion of both neuronal and mesenchymal cells (MSC), while IKVAV-CBM3 and KHIFSDDSSE-CBM3 presented only a slight effect on mesenchymal cell adhesion, and no effect on the other cells. The MSCs neurotrophin expression by cells grown on BC membranes modified with the recombinant proteins was also verified. NGF was expressed and released by cells adhered on the BC membranes, creating a microenvironment that promotes neuronal regeneration. The nitrogen plasma treatment did not increase the wettability of the material, but increased the porosity and changed the surface chemistry, as noticed by the presence of nitrogen. XPS analysis revealed the stability of the modified material along time and autoclave sterilization. The cell adhesion and proliferation of HMEC-1 and N1E-115 cells was significantly improved in the plasma treated BC, in contrast with the 3T3 cells, revealing a cell-specific effect. Regarding in vivo studies, the BC implants caused a low inflammatory reaction that decreased along time and did not elicit a foreign body reaction. A tendency for calcification, which may be related to the porosity of the BC implants, was observed. However, this tendency was different depending on the BC tested. Regarding nanofibers implants, after 2 and 4 months post implantation, mostly of injected nanofibers remained in aggregates in the subcutaneous tissue. There was infiltration of cells in these aggregates of nanofibers, mostly macrophages, and there is evidence of phagocytosis of the material by these cells. Moreover, no differences were observed between the controls and implanted animals in thymocyte populations, B lymphocyte precursors and myeloid cells in the bone marrow.BC is a good material to be used as scaffold in tissue engineering applications. However, is still necessary to improve the interaction of cells with the material to obtain a matrix that supports the growth, differentiation and selectivity of cells. In our attempt to enhance and select neuronal attachment to BC, the recombinant proteins produced were able to improve cell adhesion and viability on BC membranes. Also, nitrogen plasma treatment proved to be an effective and economical surface treatment technique, which was also capable to improve the adhesion of endothelial and neuroblast cells to the material. Therefore, the surface modification leads to a better cell affinity with BC, probably contributing for a better biocompatibility in vivo. In the in vivo results, our work points to the necessity to further investigation to verify the tendency to BC to calcify in long-term circumstances. Meanwhile, the BC nanofibers seem to be an innocuous material in mice subcutaneous tissue, and proved to be an eligible material to production of ECM-mimetic grafts.

Actualmente, um grande número de materiais poliméricos com diferentes propriedades estão disponíveis para aplicações biomédicas. Têm sido exploradas várias abordagens com o objetivo de melhorar a interação entre os polímeros e as células, que por ser geralmente inadequada, provoca reações in vivo como inflamações, perdas de tecido local e encapsulamento dos implantes. Entre estas abordagens, a modificação das superfícies, como por exemplo a funcionalização dos materiais com peptídeos imobilizados ou grupos químicos incorporados, mostra vantagens na obtenção de interações específicas das células com os materiais resultando em uma melhoria na sua biocompatibilidade. A celulose bacteriana (CB) tornou-se um biomaterial em foco para aplicações biomédicas devido a sua alta resistência mecânica, hidrofilicidade, alta cristalinidade e pureza, baixo custo de produção e sua característica rede de nanofibras. Além disso, o uso de domínios de ligação à celulose é uma alternativa simples e específica de enxertar peptídeos bioativos à estrutura da celulose possibilitando uma maior afinidade celular. O objectivo deste trabalho foi modificar a CB para aumentar a afinidade de células neuronais, produzindo um scaffold com potencial para ser utilizado em engenharia de tecidos neuronal. Com este propósito, duas estratégias foram utilizadas: 1) o uso de peptídeos de adesão conjugados a um domínio de ligação a carbohidratos (CBM), com afinidade para a celulose e, 2) modificação da CB através do tratamento com plasma de nitrogênio. Também, dentro do âmbito deste trabalho, avaliouse a biocompatibilidade a longo prazo da CB, tanto de implantes como de nanofibras implantados subcutaneamente em camundongos. As proteínas recombinantes IKVAV-CBM3, exIKVAV-CBM3 and KHIFSDDSSECBM3 foram expressas em E.coli, purificadas e adsorvidas de maneira estável nas membranes de CB. Os resultados in vitro mostraram que o exIKVAV-CBM3 aumentou a adesão de células neuronais e mesenquimais, enquanto que o IKVAV-CBM3 e KHIFSDDSSE-CBM3 apresentaram apenas um pequeno efeito na adesão das células mesenquimais, e nenhum efeito nas outras células testadas. Também, a expressão de neurotrofinas pelas células mesenquimais nas membranas de CB modificadas com as proteínas recombinantes foi verificada, e verificou-se que o NGF é expresso e libertado por estas células aderidas na CB, criando um ambiente promotor da regeneração neuronal. O tratamento com o plasma de nitrogênio não aumentou a molhabilidade da CB, mas foi capaz de aumentar a porosidade e a química de superfície, evidenciado pela presença do grupo nitrogênio. As análises de XPS mostraram a estabilidade do material modificado 180 dias após o tratamento, e após a esterilização por autoclave. A adesão e a proliferação celular das linhagens endotelial (HMEC-1) e neuronal (N1E-115) foi aumentada significativamente na celulose tratada com plasma, em contraste com os fibroblastos 3T3, o que revelou um efeito célula-específico. Quanto aos estudos in vivo, os implantes de CB causaram apenas uma reação inflamatória de baixa intensidade, que decresceu ao longo do tempo, e não estimulou reação de corpo estranho. Foi observada uma tendência para calcificar nas membranas de CB menos porosas, indicando uma relação com a porosidade dos implantes. Quanto aos implantes de nanofibras, após 2 e 4 meses de implantação, verificou-se que a maior parte das nanofibras permaneceram em agregados no tecido subcutâneo. Houve infiltração de células nesses agregados de nanofibras, sendo a maioria macrófagos, e evidências de fagocitose do material por estas células. Também, não foram encontradas diferenças entre os controles e os animais implantados nas populações de timócitos, precursores de linfócitos B e células mielóides na medula óssea. A CB é um bom material para ser utilizado em aplicações de engenharia de tecidos. Entretanto, ainda é necessário a modificação deste material para aumentar sua interação com as células, obtendo assim uma matriz capaz de manter o crescimento, a diferenciação e a seletividade de células. Na nossa tentativa de aumentar e selecionar a adesão de células neuronais à CB, as proteínas recombinantes produzidas foram capazes de aumentar a adesão e a viabilidade celular neste material. Também, o tratamento por plasma de nitrogênio provou ser um tratamento de superfície econômico e efetivo, sendo capaz de aumentar a afinidade das células com a CB, o que poderá contribuir para um melhoramento da sua biocompatibilidade in vivo. Quanto aos testes in vivo, este trabalho aponta para a necessidade de investigação futura para verificar a tendência da CB em calcificar em circunstâncias a longo prazo. Entretanto, as nanofibras de CB parecem ser inócuas quando implantadas no tecido subcutâneo, sendo um material elegível para a produção de enxertos que mimetizem a matriz extracelular.