New therapeutic strategies against Staphylococcus epidermidis biofilms

Abstract

Staphylococcus epidermidis was previously regarded as an innocuous commensal microorganism on the human skin. However, nowadays it is seen as an important opportunistic pathogen and ranks first among the causative agents of nosocomial infections on indwelling medical devices. Infections with this leading pathogen are characterized by biofilm development on devices (heart valves, catheters, contact lenses, etc.) and this factor is considered the main virulence mechanism of S. epidermidis. Biofilm cells are organised into structured communities enclosed within a matrix of extracellular material. These cells are phenotypically different from planktonic or suspended cells; notably, they resist host defences and display a significantly decreased susceptibility to antimicrobial agents. Since biofilm-associated infections are frequently resistant to conventional antimicrobial therapy, the aims of this doctoral work were to study new therapeutic strategies for treatment of infections caused by S. epidermidis. To this end, the susceptibility of planktonic and biofilm cells to farnesol, a possible antimicrobial agent against S. epidermidis, as well as the effect of farnesol on structure and composition of biofilm matrix were studied. The comparison of the effect of this compound with antibiotics traditionally used in the treatment of S. epidermidis infections such as vancomycin, tetracycline and rifampicin, and the determination of the presence of synergy of farnesol when combined with the antibiotics previously mentioned and with N-acetylcysteine (NAC) were other goals of the work. Moreover, the postantimicrobial effect (PAE) of farnesol and of the antibiotics mentioned above were determined and compared. Antibiotics combination represents a therapeutic option in the treatment of Staphylococcus infections, as a result of the increasing appearance of multi-resistant microorganisms. Taking this into consideration, this work also aimed at studying the effect of a wide range of antibiotics alone and in combination. Finally, the last purpose of the described work was the study of the genetic expression of some genes responsible for virulence of S. epidermidis biofilm cells, icaA (virulence gene - PNAG producing) and rsbU (stress regulator), after being exposed to various treatment conditions. The results showed that farnesol caused a significant reduction of cellular viability of planktonic cells and a less pronounced effect was observed on biofilm cells. The quantification of extracellular polymers and the visualization of biofilms treated with farnesol under confocal microscopy, support the hypothesis that farnesol causes disruption of the cytoplasmic membrane and consequently release of cellular content. Additionally to cell death, farnesol seems also to destroy the biofilm structure and the biofilm matrix reducing the amount of poly-Nacetylglucosamine (PNAG) exopolysaccharide in the biofilm matrix. This general impairment of the biofilm caused by farnesol may be a potential help to the human immune system to eradicate focus of Staphylococcus epidermidis infections. With few exceptions, none of the antibiotics tested and NAC worked in synergy with farnesol. In some cases, farnesol was as effective as the antibiotics tested, being a possible alternative to antibiotics. Furthermore, farnesol has demonstrated to have a pronounced PAE comparatively to the antibiotics tested. All our results suggest farnesol as a potential antimicrobial therapeutic agent against S. epidermidis infections. Another potential alternative to antibiotics may be the use of NAC as a therapeutic agent, since it had a pronounced antimicrobial effect on both planktonic cells and biofilms. To overcome the problem of resistance to antibiotics, we also tested the susceptibility of biofilm cells to double combinations of antibiotics, and some combinations demonstrated to be effective against S. epidermidis biofilms, namely those containing rifampicin. Two of these combinations were rifampicin+clindamycin and rifampicin+gentamicin. These two combinations induced a lower genetic expression of icaA and rsbU genes, responsible for PNAG/PIA production and consequently can reduce biofilm formation recidivism, in comparison with rifampicin alone. This seems to be an additional advantage of the combinatorial therapy over monotherapy.

Staphylococcus epidermidis foi anteriormente considerado um microorganismo comensal inócuo presente na pele humana. Porém, hoje em dia é visto como um importante patogénico oportunista e ocupa o primeiro lugar entre os agentes causadores de infecções hospitalares associadas ao uso de dispositivos médicos. As infecções causadas por este patogénico são caracterizados pelo desenvolvimento de biofilmes na superfície desses dispositivos implantados no doente (válvulas cardíacas, catéteres, lentes de contacto, etc.), sendo este factor considerado o principal mecanismo de virulência desta bactéria. As células em biofilme estão organizadas em comunidades estruturadas, envolvidas por uma matriz constituída por material extracelular. Estas células são fenotipicamente diferentes das células planctónicas ou suspensas; nomeadamente porque têm maior resistência às defesas do hospedeiro e exibem uma susceptibilidade diminuída aos agentes antimicrobianos. Uma vez que as infecções associadas a biofilmes são frequentemente resistentes à terapia antimicrobiana convencional, os objectivos deste trabalho de doutoramento consistiram no estudo de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de infecções provocadas por S. epidermidis. Para isso, estudou-se a susceptibilidade de células planctónicas e em biofilme a outros agentes antimicrobianos tais como o farnesol, bem como o efeito desta molécula sobre a estrutura e a composição da matriz do biofilme. A comparação do efeito deste composto com antibióticos tradicionalmente utilizados no tratamento de infecções causadas por S. epidermidis, como por exemplo a vancomicina, tetraciclina e rifampicina, e a determinação da presença de sinergia do farnesol quando combinado com os antibióticos previamente citados e com Nacetilcisteína (NAC) foi outro dos objectivos do trabalho. Foi também determinado o efeito pósantimicrobiano (PAE) do farnesol e dos antibióticos anteriormente mencionados. Devido ao crescente aparecimento de microrganismos multi-resistentes tem-se recorrido à combinação de antibióticos como uma opção terapêutica no tratamento de infecções por estafilococos. Assim, este trabalho teve também como objectivo o estudo do efeito de uma ampla gama de antibióticos isolados e em combinação. Finalmente, o último propósito do trabalho consistiu no estudo da expressão de alguns genes, responsáveis pela virulência de células de S. epidermidis em biofilme, icaA (gene de virulência – produção de PNAG) e rsbU (regulador de stress), após terem sido expostas a diferentes condições de tratamento. Verificou-se que o farnesol causou uma redução significativa da viabilidade das células planctónicas mas um efeito menos pronunciado em células em biofilme. A quantificação de polímeros extracelulares e a visualização com microscópio confocal dos biofilmes tratados com farnesol apoiam a hipótese de que o farnesol causa o rompimento da membrana citoplasmática das células e, consequentemente, a libertação de conteúdo celular. Para além de provocar morte celular, o farnesol também parece destruir a matriz e a estrutura do biofilme, reduzindo a quantidade do exopolissacarídeo, poli-N-acetilglicosamina (PNAG) na matriz do biofilme. Este enfraquecimento geral do biofilme provocado pelo farnesol pode ser uma potencial ajuda para o sistema imunológico humano na erradicação do foco de infecção por Staphylococcus epidermidis. Excepto raras excepções, nenhum dos antibióticos testados e NAC apresentaram sinergia com o farnesol. Em alguns casos, o farnesol teve uma eficácia semelhante à dos antibióticos testados, sendo uma possível alternativa a estes agentes antimicrobianos. Além disso, o farnesol demonstrou ter um PAE elevado relativamente aos antibióticos testados. Todos estes resultados sugerem que o farnesol pode ser utilizado como um potencial agente terapêutico antimicrobiano no combate a infecções provocadas por S. epidermidis. Outra potencial alternativa aos antibióticos poderá ser o uso de NAC como agente terapêutico visto este apresentar um pronunciado efeito antimicrobiano quer em células planctónicas quer em biofilmes. Para superar o problema da resistência aos antibióticos, testou-se também a susceptibilidade dos biofilmes a combinações duplas de antibióticos, tendo-se verificado que algumas combinações demonstraram ser muito eficazes contra biofilmes de S. epidermidis. Duas destas combinações foram rifampicina+clindamicina e rifampicina+gentamicina. Estas duas combinações induziram uma menor expressão dos genes icaA e rsbU, responsáveis pela produção de PNAG/PIA e podem consequentemente reduzir a reincidência de formação de biofilme, em comparação com a rifampicina isolada. Esta parece ser uma vantagem adicional da terapia combinatória em relação à monoterapia.