Potential of human bone marrow derived stem cells combined with chitosan based biodegradable scaffolds for bone tissue engineering

Abstract

Bone tissue engineering has emerged as a promising alternative in cases of bone loss, overcoming problems of rejection and donor scarcity associated to the clinical used bone grafts (autografts, allografts and xenografts). By combining threedimensional structures (3D) – scaffolds, autologous cells and growth factors, bone tissue engineering seeks to achieve a long lasting and fully functional regeneration of bone. The selected scaffold should be biodegradable, allowing cells to adhere, proliferate and differentiate into the osteogenic phenotype, producing a mineralized extracellular matrix (ECM), to be later implanted into the bone defect. The rate of degradation of the scaffold should, therefore, be compatible to the rate of neo-tissue ingrowth. The rationale of the experimental work of this thesis was designed to study a bone tissue engineering strategy by combining chitosan based scaffolds and human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs), aiming bone tissue regeneration. Blends of chitosan with different types aliphatic polyesters were produced by extrusion. Afterwards, scaffolds were produced by compression molding followed by salt leaching. Several scaffolds formulations were produced and subjected to cytotoxicity and cytocompatibility tests, allowing selecting the most suitable formulation in terms of biological response. From the results obtained, the chitosanpoly( butylene succinate) (PBS) formulation presented the most promising results in in vitro cell studies with relevant cell lines. To understand why this formulation has enhanced cell performance, several formulations using different percentages of chitosan (0, 25 and 50%) and PBS (100, 75 and 50%) were used to produce scaffolds. The influence of chitosan content was evaluated with hBMSCs in vitro. All in vitro results evidenced a better performance for the highest chitosan containing scaffolds, as for cell adhesion and proliferation, as for osteogenic differentiation. Scaffolds containing chitosan (50% chitosan-50% PBS) and without chitosan (100% PBS) were implanted in different anatomic regions (cranial defect, auricular pocket and submuscular) of rats. The tissue response was evaluated by studying the inflammatory response to the implanted scaffolds. Again, scaffolds with higher chitosan amounts evidenced superior results, with a mild inflammatory response without cell necrosis, in vivo, as compared to PBS scaffolds, that evidenced tissue necrosis in all implantation regions. A different morphology of chitosan-PBS scaffolds was developed by fiber bonding to improve the porous structure. These scaffolds were clearly non-cytotoxic and cytocompatible. Furthermore, chitosan-PBS scaffolds seeded and cultured with hBMSCs in osteogenic conditions, showed an excellent cell performance. The biodegradation of chitosan-PBS scaffolds was assessed in vitro using enzymes responsible for the degradation of chitosan (lysozyme) and PBS (lipase), in similar concentrations to the ones found in human body. The cocktail of both enzymes induced a superior effect on the scaffolds biodegradation. The in vivo biodegradation and biocompatibility of the scaffolds were evaluated. The in vivo model applied to this study was the rat subcutaneous model. Results showed that the in vivo degradation was much slower than in vitro. The host tissue response was the typically associated with biomaterialsʼ implantation, with the presence of foreign body giant cells and an inflammatory response that progressed over time. The in vivo response was similar to those observed for biodegradable fixation devices or bioresorbable sutures. The final study included in this thesis was performed to confirm the tissue engineering strategy followed in this work. The potential of chitosan-PBS scaffolds combined with hBMSCs, as previously demonstrated, was studied in a relevant animal model. A critical size cranial defect in nude mice was used. This model allowed evaluating the in vivo matured construct using human cells. The results showed that constructs were able to promote bone regeneration in a superior level than scaffolds without cells. The strategy followed under the scope of this PhD thesis was successfully validated in this small animal model, using a combination of chitosan-poly(butylene succinate) scaffolds with hBMSCs.

A área de engenharia de tecidos ósseos surgiu como uma alternativa de tratamento em casos clínicos de perdas ósseas, evitando problemas de rejeição e morbidez associada a enxertos ósseos obtidos do próprio paciente. Combinando estruturas tridimensionais (3D) porosas, células autólogas e factores de crescimento, a engenharia de tecidos ósseos visa encontrar soluções para a regeneração de osso neste tipo de pacientes. O suporte 3D seleccionado deverá ser biodegradável, permitindo a adesão, proliferação e diferenciação osteogénica das células, de forma a produzir uma matriz extracelular mineralizada, sendo posteriormente implantada no defeito ósseo. A taxa de degradação do suporte 3D poroso deverá ser compatível com a taxa de regeneração do tecido ósseo O objectivo do trabalho experimental desenvolvido nesta tese foi planeado de forma validar uma estratégia de engenharia de tecidos ósseos, através da combinação de suportes 3D porosos biodegradáveis à base de quitosano e células estaminais adultas de origem humana obtidas a partir de medula óssea. Neste trabalho foram produzidas várias misturas de quitosano com diferentes tipos de poliésteres alifáticos usando a técnica de extrusão. Usando estas misturas desenvolveram-se suportes tridimensionais que foram processados por moldação por compressão com partículas de sacrifício de sal. As misturas produzidas foram avaliadas em termos de citotoxicidade e citocompatibilidade. Desta forma, foi possível seleccionar a formulação mais adequada em termos de resposta biológica. A formulação de quitosano e polibutileno succinato (PBS) foi a formulação seleccionada para posterior desenvolvimento da estratégia de engenharia de tecidos. Por ter tido consistentemente os melhores resultados biológicos in vitro, a mistura seleccionada foi usada para produzir suportes porosos contendo diferentes percentagens de quitosano (0, 25 and 50%) e PBS, de forma a estudar a importância do quitosano nas formulações. A influência da percentagem de quitosano nos suportes porosos foi avaliada através de estudos in vitro com culturas primárias de células estaminais mesenquimais de origem humana. Os resultados celulares obtidos mostraram um melhor desempenho em termos de adesão e proliferação, assim como na diferenciação osteogénica das células nos suportes 3D com maior percentagem de quitosano. Tendo-se observado uma maior eficácia no desempenho biológico dos suportes porosos contendo quitosano, interessava confirmar estes resultados in vivo, tendo como controlo suportes sem quitosano, só com PBS. Suportes porosos sem quitosano e com quitosano (50%), uma vez que foram aqueles para os quais se obteve o pior e o melhor comportamento celular in vivo respectivamente, foram implantados em diferentes regiões anatómicas (defeito craniano, implantação auricular e submuscular) em ratos. A resposta inflamatória foi avaliada, tendo os suportes porosos com quitosano evidenciado uma resposta inflamatória moderada, não se observando necrose celular. Suportes porosos com apenas PBS na sua constituição, mostraram necrose celular em todos os locais anatómicos implantados.O passo seguinte passou por optimizar a morfologia dos suportes, tendo sido neste caso desenvolvida uma estrutura porosa de malha de fibras de quitosano e PBS, por compressão a quente. Estes suportes porosos foram avaliados e confirmou-se também que não eram citotóxicos e que eram citocompatíveis. Adicionalmente, foram cultivadas células primárias humanas de medula óssea nestas estruturas tridimensionais, em condições de diferenciação osteogénica, mostrando um excelente desempenho in vitro. A biodegradação destes suportes porosos de quitosano-PBS foi estudada usando enzimas responsáveis pela degradação do quitosano (lisozima) e PBS (lipase) em concentrações idênticas às encontradas no corpo humano. Os resultados obtidos mostraram que um cocktail das duas enzimas teve um efeito pronunciado no que respeita à taxa de degradação dos suportes porosos. O estudo foi complementado pela análise da biodegradação e biocompatibilidade dos suportes tridimensionais in vivo. O modelo in vivo escolhido para este estudo foi o implante subcutâneo em ratos. Os resultados obtidos mostraram que a taxa de degradação in vivo foi consideravelmente menor comparativamente com os estudos efectuados in vitro. A resposta in vivo foi semelhante à observada em implantes de placas de fixação óssea biodegradáveis ou em suturas bioabsorvíveis. O último estudo incluído nesta tese foi realizado para confirmar a estratégia de engenharia de tecidos proposta neste trabalho: a associação de suportes porosos biodegradáveis de quitosano e PBS e células estaminais humanas de medula óssea diferenciadas para a linhagem osteogénica. O potencial desta estratégia foi estudado num modelo animal relevante: um defeito craniano de tamanho crítico em ratinhos imunocomprometidos. Este modelo permitiu avaliar o efeito da implantação dos suportes porosos cultivados com células humanas naqueles defeitos ósseos. Os resultados obtidos mostraram que esta associação de suportes porosos de quitosano-PBS com células humanas pré-cultivados in vitro em condições osteogénicas, promoveram regeneração óssea de uma forma mais significativa quando comparados com suportes porosos implantados sem células. A estratégia de engenharia de tecidos seguida no âmbito desta tese de doutoramento, através da combinação de suportes porosos de quitosano-PBS e células estaminais humanas de medula óssea foi validada com sucesso neste modelo animal de pequeno porte.