Model-based strategies for computer-aided operation of recombinant E. coli fermentation

Abstract

The main objectives of this thesis were the development of model-based strategies for improving the performance of a high-cell density recombinant Escherichia coli fed-batch fermentation. The construction of a mathematical model framework as well as the derivation of optimal and adaptive control laws were used to accomplish these tasks. An on-line data acquisition system was also developed for an accurate characterization of the process and for the implementation of the control algorithms. The mathematical model of the process is composed of mass balance equations to the most relevant state variables of the process. Kinetic equations are based on the three possible metabolic pathways of the microorganism: glucose oxidation, fermentation of glucose and acetate oxidation. A genetic algorithm was used to derive the kinetic structure and to estimate both yield and kinetic coefficients of the model, minimizing the normalized quadratic differences between simulated and real values of the state variables. After parameter estimation, a sensitivity function analysis was applied to evaluate the influence of the various parameters on model behavior. Sensitivity functions revealed the sensitivity of the state variables to variations in each model parameter. Thus, essential parameters were selected and the model could be re-written in a simplified version that could also describe accurately experimental data. A system for the on-line monitoring of the major state variables was also developed. Glucose and acetate concentrations were measured with a developed Flow Injection Analysis system, while the carbon dioxide and oxygen transfer rates were calculated from data obtained with exhaust gas analysis. The fermentation culture weight was also continuously assessed with a balance, allowing the use of more precise mass-based concentrations, while environmental variables like pH, dissolved oxygen and temperatures were controlled and assessed via a Digital Control Unit. The graphical programming environment LabVIEW was used to acquire and integrate these variables in a supervisory computer, allowing the performance of integrated monitoring and control of the process. A model-based adaptive linearizing control law was derived for the regulation of acetate concentration during fermentations. The non-linear model was subjected to transformations in order to obtain a linear behavior for the control loop when a non-linear control is applied. The implementation of the control law was performed through a C script embedded in the supervisory LabVIEW program. Finally, two optimization techniques for the maximization of biomass concentration were compared: a first order gradient method and a stochastic method based on the biological principle of natural evolution, using a genetic algorithm. The former method revealed less efficient concerning to the computed maximum, and dependence on good initial values.

A presente tese teve como principais objectivos o desenvolvimento de estratégias baseadas em modelos para melhorar o desempenho da fermentação em modo semi-continuo em altas densidades celulares de Escherichia coil recombinada. Para o efeito, foi construído um modelo matemático representativo do processo e a partir deste foram desenvolvidos algoritmos de controlo óptimo e adaptativo. De forma a possibilitar a implementação de leis de controlo em linha e a caracterização do processo fermentativo, foi desenvolvido um sistema informático de aquisição e envio de dados. O modelo matemático representativo do processo em estudo foi elaborado tendo por base as equações dinâmicas de balanço mássico para as variáveis de estado mais relevantes, contemplando as três possíveis vias metabólicas do microrganismo. A estrutura cinética, bem como os parâmetros do modelo foram determinados por recurso a uma abordagem sistemática tendo por base a minimização das diferenças quadráticas entra dados reais e dados simulados, com recurso a uma ferramenta de optimização estocástica denominada de Algoritmos Genéticos. Após a etapa de identificação do modelo matemático, foram calculadas as sensibilidades relativas ao longo do tempo das variáveis de estado do modelo relativamente aos vários parâmetros determinados. Os resultados desta análise de sensibilidade possibilitaram avaliar a relevância de cada um dos parâmetros em causa, permitindo propor uma estrutura de modelo menos complexa, por exclusão dos parâmetros menos importantes. O sistema elaborado para a aquisição e envio em linha de dados da fermentação inclui um sistema de FIA (Flow Injection Analysis) desenvolvido para a medição das concentrações de acetato e glucose, uma unidade de controlo digital que controla as variáveis físicas mais relevantes para o processo, e um equipamento de Espectrometria de Massas para analisar as correntes gasosas de entrada e saída do fermentador. O sistema dispõe ainda de duas balanças, uma das quais para a aferição em linha do peso do caldo de fermentação, permitindo o use de concentrações mássicas que proporcionam resultados mais exactos. A aquisição e integração destas variáveis medidas são, efectuadas através de um software de supervisão elaborado no ambiente de programação gráfico LabVIEW. Adicionalmente, foi elaborada uma lei de controlo adaptativo linearizante para a regulação da concentração de acetato no meio de fermentação. A síntese da lei de controlo não linear foi efectuada por técnicas de geometria diferencial com linearização do sistema por retroacção de estado. A adaptação foi feita tendo por base a estimação de parâmetros variáveis no tempo, nos quais se concentram as incertezas do modelo. A implementação ao processo real da referida lei de controlo foi efectuada por recurso a um programa elaborado em C incluindo no programa supervisor elaborado em LabVIEW. Finalmente, para a optimização da quantidade de biomassa formada no final da fermentação por manipulação do caudal de alimentação, foram estudadas duas ferramentas de optimização: um método de gradiente e uma ferramenta baseada em Algoritmos Genéticos. Esta última revelou-se mais eficaz tanto na convergência para o valor óptimo, como na estimativa inicial fornecida.