Assessing the antifungal potential of Hypholoma fasciculare and its adherence to the roots of Castanea sativa

Abstract

In the region of Trás-os-Montes the chestnut has a high economic importance. In recent years, there has been a decrease of the area occupied by the chestnut, due to the emergence of diseases, like the ink disease, caused by Phytophthora cinnamomi and P. cambivora, or blight canker, caused by C. parasitica. The presence of the fungus Hypholoma fasciculare was recently observed in the chestnut orchards of Trás-os-Montes (Bragança). Preliminary studies have suggested that this fungus causes serious damage to chestnut trees. H. fasciculare seems also to have an expressive antagonistic action against various fungi, some of which harmful and other beneficial, which could compromise the chestnut orchard sustainability. In order to evaluate the consequences arising from the use of H. fasciculare as a biological control agent, the antagonistic spectrum of this fungus was assessed against different fungi using the dual culture method. The results indicate that H. fasciculare exerts an antagonist action against distinct fungi, but also presents its growth affected by the interaction. Keeping in mind the possible purification of compounds with antagonistic potential a fast and effective method to evaluate antimicrobial activity is desirable. Since the method of co-culture between filamentous fungi is relatively slow, requiring approximately 12 to 15 days for giving results, a new assay was optimized by using yeasts as indicators of antagonistic activity of H. fasciculare. Given the sensitivity of the tested yeasts and its high growth rate, this new assay not only proved to be suitable but also faster to evaluate antimicrobial activity of H. fasciculare. This method is proposed to be used in place of the traditional method of co-culture for assessing the antimicrobial potential. The same assay, performed with Gram-positive and Gram-negative bacteria, also revealed the antibacterial activity of compounds produced by H. fasciculare. The interaction between C. sativa - H. fasciculare was evaluated by the macroscopic characterization of fungal adhesion to chestnut roots. Since the hydrophobin proteins could be involved in the adhesion process, the identification of the full sequence of the corresponding cDNA was attempted using RNA samples purified from samples collected during the process of interaction root-fungus. The prior identification of a genomic DNA sequence of H. fasciculare hydrophobin gene allowed starting the process of identifying the cDNA sequence of the same gene.

Na região de Trás-os-Montes o castanheiro possui uma elevada importância económica. Nos últimos anos, tem-se assistido a um decréscimo da área ocupada pelo castanheiro, devido ao aparecimento de doenças como a doença da tinta, causada por Phytophthora cinnamomi e P. cambivora; e o cancro cortical, causado por C. parasitica. A presença do fungo Hypholoma fasciculare foi recentemente observada em soutos de Trás-os-Montes (Bragança). Estudos preliminares evidenciaram que este fungo causa sérios danos aos castanheiros. H. fasciculare possui ainda uma expressiva acção antagonista contra diversos fungos presentes no solo dos soutos, prejudiciais e benéficos, o que poderá comprometer a sustentabilidade dos soutos. Durante este projecto avaliou-se o espectro de acção antagonista de H. fasciculare contra diversos fungos, utilizando o método de cultura dupla, de forma a avaliar as consequências decorrentes da utilização deste fungo como agente de controlo biológico. Os resultados indicam que H. fasciculare exerce uma acção antagonista contra os fungos testados, mas também apresenta o seu crescimento afectado pela interacção. Com vista a uma possível purificação dos compostos com potencial antagonista é desejável um método rápido e eficaz para avaliar a actividade antimicrobiana. Dado que o método de co-cultura entre fungos filamentosos é relativamente moroso, requerendo cerca de 12 a 15 dias para visualizar os resultados, um novo ensaio foi optimizado, utilizando leveduras como microrganismos indicadores de sensibilidade à actividade antagonista de H. fasciculare. Dada a sensibilidade das leveduras testadas e a sua elevada taxa de crescimento, este novo ensaio revelou-se não só adequado como mais rápido para avaliar a actividade antimicrobiana de H. fasciculare. Propõe-se assim a sua utilização em substituição do tradicional método de co-cultura para avaliar o potencial antimicrobiano do fungo em estudo. O mesmo ensaio, realizado com bactérias Gram-positivas e Gramnegativas, revelou ainda a actividade antibacteriana de compostos produzidos por H. fasciculare. O estabelecimento da interacção entre C. sativa - H. fasciculare foi avaliado pela caracterização macroscópica da adesão do fungo às raízes de castanheiro. Dado que no processo de adesão poderão estar envolvidas hidrofobinas, a identificação da sequência completa do seu cDNA foi tentada recorrendo à purificação de RNA de amostras recolhidas durante o processo de interacção raíz-fungo. A partir da prévia identificação de uma sequência de DNA genómico de hidrofobina de H. fasciculare foi iniciado o processo de identificação da sequência de cDNA do mesmo gene.