Yeast as a model system for the study of Bax regulation by protein kinase C isoforms

Abstract

Programmed cell death (PCD), of which apoptosis is the most common morphological expression, is an orchestrated collapse of the cell resulting from the activation of a widely described cascade of molecular events. Due to the importance of this process in tissue homeostasis and development of multicellular organisms, its deregulation is associated with several disorders, including cancer and neurodegenerative diseases. A crucial event in mammalian apoptosis is the permeabilization of mitochondrial outer membrane and the release of several apoptogenic factors responsible for activation of different proteases involved in the dismantling of the apoptotic cell. The Bcl-2 protein family plays a central role in this permeabilization. A better knowledge of this process and its regulation will probably lead to the development of novel therapeutic strategies for treatment of apoptosis-related diseases. However, the mode of action of Bcl-2 protein family and its regulation are not completely understood. Protein kinase C (PKC) is a family of serine/threonine kinases that is involved in the transduction of signals that control different cellular processes including cell death and proliferation. In the last decade the role of PKC in apoptosis regulation has been highlighted. This family comprises at least 12 isoforms that regulate apoptosis in an isoform-specific manner. However, the co-existence of several PKC isoforms in the same cell and the different expression patterns observed in different cell types often lead to contradictory reports about the role of each individual isoform in apoptosis regulation. Yeast has proved to be a powerful tool to investigate the molecular aspects of several biological processes, including the steps of the apoptotic cascade involving mitochondria. Yeast does not have obvious homologues of the mammalian Bcl-2 family proteins and, though yeast has a PKC orthologue, the mammalian PKCs do not functionally complement this kinase. However, when these mammalian proteins are expressed in yeast, they conserve some of their molecular and biochemical functions. This favours the use of this simpler model system to unravel some of the functions of this family. Recently it has been shown that distinct PKC isoforms can differently modulate Bcl-xL anti-apoptotic effect in yeast illustrating the possibility of using the yeast cell model to study regulation of Bcl-2 family proteins by PKC isoforms. Following these results we set out to exploit this model system to study the regulation of Bax by PKCα, δ, ε and ζ. In this thesis, it is shown that the classical PKCα increases the translocation and insertion of Bax c-myc (active and tagged human Bax with mitochondrial localization) into the outer membrane of yeast mitochondria. This is associated with an increase in cytochrome c (cyt c) release, reactive oxygen species production, mitochondrial network fragmentation and cell death. This cell death process is regulated, since it correlates with an increase in autophagy but not with plasma membrane permeabilization. Moreover, it was shown that Bax c-myc is not phosphorylated in yeast and that the observed increase in translocation and insertion of Bax into mitochondria in the presence of PKCα is not due to Bax c-myc phosphorylation. However, PKCα leads to dephosphorylation of Bax α (inactive human Bax with cytosolic localization) but does not interfere with cell viability or change Bax α translocation and insertion into mitochondria and cyt c release. Furthermore, it was demonstrated that the enhancement of Bax c-myc-induced cell death by PKCα is independent of the PKCα kinase activity. Nevertheless, PKCα inhibits cell death induced by BaxP168A (human Bax with a single point mutation that increase its activity), an effect that is abolished when the PKCα kinase activity is abrogated. It was also demonstrated that the novel PKCε leads to Bax α dephosphorylation an effect that is associated to inhibition of Bax α translocation into mitochondria. The novel PKCδ and the atypical PKCζ had no detectable effect in Bax α phosphorylation and translocation into mitochondria. Altogether, these results give a mechanistic insight on apoptosis regulation by PKC isoforms showing that they distinctly regulate Bax activity. Moreover, these studies provide a proof of principle of yeast as an important tool to elucidate some the mechanisms by which PKC regulates the apoptotic process.

A morte celular programada (MCP), da qual a apoptose é a expressão morfológica mais comum, é o colapso orquestrado da célula resultante da activação de uma cascata de eventos moleculares amplamente descrita. Devido à importância deste processo na homeostasia e desenvolvimento de organismos pluricelulares, a sua desregulação está associada a diversas patologias, incluindo cancro e doenças neurodegenerativas. A permeabilização da membrana mitocondrial externa, e a libertação de vários factores apoptogénicos responsáveis pela activação das diferentes proteases envolvidas no desmantelamento da célula apoptótica é um evento crucial da apoptose em mamíferos. A família das proteínas Bcl-2 desempenha um papel decisivo na permeabilização. Um melhor conhecimento deste processo e da sua regulação irá provavelmente conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças relacionadas com a apoptose. No entanto, o modo de acção das proteínas da família Bcl- 2 e a sua regulação não está completamente esclarecido. As proteínas cinase C (PKC) são uma família de cinases serina/treonina envolvida na transdução de sinais que controlam diversos processos celulares, incluindo morte celular e proliferação. Na última década o papel da PKC na regulação da apoptose foi destacado. Esta família contém pelo menos 12 isoformas que regulam a apoptose de uma forma específica. No entanto, a coexistência de várias isoformas da PKC na mesma célula e os diferentes padrões de expressão observados em diferentes tipos celulares conduzem com frequência a resultados contraditórios sobre o papel de cada isoforma na regulação da apoptose. A levedura já provou ser uma ferramenta importante na investigação de vários processos biológicos, incluindo os passos da cascata apoptótica que envolvem a mitocôndria. A levedura não tem homólogos das proteínas da família Bcl-2 de mamíferos e, embora possua um homólogo da PKC, as PKCs de mamífero não complementam funcionalmente esta cinase. No entanto, quando estas proteínas de mamífero são expressas em levedura, elas conservam algumas das suas funções moleculares e bioquímicas. Isto favorece o uso deste modelo mais simples para compreender algumas das funções desta família. Recentemente verificou-se que diferentes isoformas da PKC modulam distintamente o efeito anti-apoptótico de Bcl-xL em levedura demonstrando a possibilidade do uso da levedura como modelo para o estudo da regulação das proteínas da família Bcl-2 pelas isoformas da PKC. Após estes resultados decidimos explorar o modelo da levedura para estudar a regulação de Bax por PKCα, δ, ε e ζ. Nesta tese, mostra-se que a PKCα aumenta a translocação e inserção de Bax c-myc (Bax humano activo com localização mitocondrial) para a membrana mitocondrial externa da mitocondria de levedura. Este evento está associado a um aumento da libertação de citocromo c (cit c), produção de espécies reactivas de oxigénio, fragmentação da rede mitocondrial e morte celular. Este processo de morte celular é regulado, pois correlaciona-se com um aumento de autofagia mas não com a permeabilização da membrana plasmática. Também foi demostrado que Bax c-myc não é fosforilado em levedura e que o aumento da translocação e inserção de Bax na mitocôndria na presença de PKCα não se deve à fosforilação de Bax c-myc. No entanto, PKCα leva à desfosforilação de Bax α (Bax humano inactivo com localização citosólica) mas não interfere com a viabilidade celular ou altera a translocação e inserção de Bax α na mitocôndria e a libertação de cit c. Foi também demonstrado que o aumento da morte celular induzida por Bax c-myc pela PKCα é independente da actividade catalítica de PKCα. Contudo, PKCα inibe a morte celular induzida por BaxP168A (Bax humano com uma mutação num aminoácido que aumenta a sua actividade), um efeito que desaparece quando a actividade catalítica de PKCα é eliminada. Foi também comprovado que PKCε induz desfosforilação de Bax α, um efeito que está associado à inibição da translocação de Bax α para a mitocôndria. As isoformas PKCδ e ζ não têm nenhum efeito detectável na fosforilação e translocação de Bax α para a mitocôndria. Em conjunto, os resultados aqui descritos contribuem para uma melhor compreensão da regulação da apoptose por isoformas de PKC, evidenciando uma diferente regulação da actividade de Bax por cada isofoma. Além disso, estes estudos demonstram a importância do uso da levedura como ferramenta para a elucidação dos mecanismos pelos quais as isoformas de PKC regulam o processo apoptótico.