RTKs and MAPK pathway alterations in solid tumors: dissecting prognostic and therapeutic biomarkers

Abstract

Cancer treatment is being revolutionized by the translation of knowledge achieved in cancer biology studies in the development of new drugs that act by molecular recognition. The discovery of alterations on receptor tyrosine kinases (RTKs) and intracellular signaling pathways, including the mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade, has lead to the development of such successful molecular targeted therapies. However, the understanding of cancer molecular genetics suggests that the complex heterogeneity of human malignancies is a major limitation for the application of these novel cancer treatment approaches. To overcome this obstacle, it is necessary the identification of altered molecular targets in each particular tumor type. In view of this, the general aim of this thesis was to contribute to a better knowledge of molecular alterations occurred on RTKs and MAPK cascade governing tumorigenesis in some tumor types, such as gastrointestinal stromal tumors (GISTs), cervical cancer and gliomas. GISTs, are known to be driven by oncogenic mutations in KIT and PDGFRA, and constitutes in nowadays the paradigm of how molecular targeted therapies can have a major impact on patients survival. Patients with particular mutations in these two oncogenes are successfully treated with imatinib (Gleevec®, Novartis), a KIT and PDGFRA pharmacological inhibitor. Besides mutations in these two RTKs, the knowledge of alternative molecular alterations in KIT&PDGFRA wild-type GISTs is scarce. MAPK pathway deregulation in cancer is mainly driven by activating mutations on RAS and BRAF oncogenes, and more recently by RKIP protein downregulation. In the present work, in the absence of RAS and RKIP alterations, we found that MAPK pathway can be activated in KIT&PDGFRA wild-type GISTs through autocrine/paracrine mechanisms between KIT and its ligand SCF, and/or by mutated BRAF. In addition, in a large series of cases -including KIT&PDGFRA mutated tumors- we found also that the absence of RKIP expression is associated with poor prognosis in GIST patients. The central role of KIT and PDGFRA mutations in the prediction of imatinib treatment in GISTs has led to the screening of these alterations in other tumors to identify novel patients that can benefit from the same therapy. In addition, the emergent role of RKIP in MAPK regulation and in patients‟ prognosis has highlighted the importance of screening for other tumors with RKIP altered expression. Therefore, we screened for KIT and PDGFRA alterations, and evaluated the clinical and biological role of RKIP in other two important tumors types: cervical cancer and gliomas. Concerning cervical cancer, we screened for KIT molecular alterations in a particular subtype of cervical cancer, the adenosquamous carcinomas, which are less frequent, yet with a very aggressive behavior. We found that KIT protein can be activated trough autocrine/paracrine loops with the ligand SCF in a subset of tumors, besides the absence of KIT mutations or gene amplification. Furthermore, we report that RKIP protein is significantly lost in cervical carcinomas, and provide in vitro and in vivo evidences that RKIP depletion induces angiogenesis and cellular viability, migration and anchorage independent growth in cervical cancer. Regarding gliomas, we described the co-expression of PDGFA and PDGFRA, and suggested PDGFRA gene amplification, rather than gene mutation, as the underlying genetic mechanism driving PDGFRA overexpression in these tumors. Our results prompted us to screen for the effectiveness PDGFRA-targeted therapies in gliomas. In a panel of glioma cell lines, we found that cediranib (Rencentin®, Astrazeneca) is an effective treatment option when compared to other PDGFRA targeted therapies, such as imatinib and sunitinib (Sutent®, Pfizer). Importantly, we showed that cediranib and sunitinib have in gliomas a distinct profile of RTK targets than those previously described. Finally, similar to the findings on GISTs and cervical cancer, we observed that RKIP is lost in glial tumors and is associated with a highly malignant phenotype, constituting an independent predictor of clinical outcome in glioma patients. In conclusion, this thesis suggests that RTKs and MAPK pathway alterations screening has to be done to each specific tumor type. Moreover, the identification of new targets of cediranib and sunitinib in gliomas raise the hope for novel potential predictive biomarkers for such therapies response. Thus, even knowing that there is yet a long way to go, the findings of this thesis could constitute a step forward to provide in the future a new molecular based therapeutic window for some of those patients.

O tratamento oncológico tem sido revolucionado pela translação dos conhecimentos da biologia tumoral no desenvolvimento de novos fármacos que actuam através do reconhecimento molecular. A descoberta de alterações em receptores tirosina cinase (RTK) e em vias de sinalização celular, como a via das proteínas cinases activadas por mitógeneos (MAPK), tem possibilitado o desenvolvimento de terapias moleculares dirigidas de sucesso em cancro. No entanto, a complexa heterogeneidade genética dos tumores humanos pode constituir uma limitação para a aplicação deste tipo de terapias. Para ultrapassar este problema é necessária a identificação de alterações em alvos moleculares terapêuticos em cada tipo tumoral específico. Assim sendo, o principal objectivo desta tese foi contribuir para um melhor conhecimento das alterações moleculares em RTKs e via de sinalização MAPK em tumores estromais gastrointestinais (GIST), tumores do colo uterino e em gliomas. Os GISTs, caracterizados pela presença de mutações oncogénicas nos genes KIT e PDGFRA, representam actualmente o paradigma de como as terapias moleculares dirigidas podem ter um impacto importante na sobrevida dos doentes. Doentes com mutações específicas nestes dois oncogenes são tratados com sucesso com imatinib (Gleevec®, Novartis), um fármaco inibidor específico de KIT e PDGFRA. No entanto, existem doentes cujos tumores são wild-type para KIT e PDGFRA e o conhecimento de outras alterações moleculares nestes doentes é escassa. A desregulação da via das MAPK em tumores ocorre principalmente devido à presença de mutações activantes nos oncogenes RAS e BRAF, e como descrito mais recentemente, pela perda de expressão da proteína RKIP. No presente trabalho, verificámos que a via das MAPK pode estar activa neste subtipo de doentes, pela presença de mecanismos autócrinos/parácrinos entre KIT e o seu ligando SCF, ou pela presença de mutações no gene BRAF, e não através de alterações nas proteínas RAS e RKIP. Adicionalmente, numa série maior de casos -incluindo mutantes para KIT e PDGFRA- encontrámos que a ausência de expressão da RKIP está associada com mau prognóstico em doentes com GIST. O sucesso da presença de mutações nos genes KIT e PDGFRA na predição da resposta ao tratamento com imatinib em GISTs, tem incitado ao rastreio de outros tumores que possuam as mesmas alterações, e que possam assim, beneficiar de uma mesma terapia eficaz. Adicionalmente, o papel emergente da proteína RKIP na predição do prognóstico de pacientes oncológicos tem destacado a importância da pesquisa de tumores com expressão alterada de RKIP. Neste sentido, investigamos a presença de alterações em KIT e PDGFRA e avaliamos o impacto biológico e clínico da proteína RKIP em outros dois importantes tipos tumorais: tumores do colo uterino e gliomas. Em relação ao cancro do colo do útero, estudámos as alterações moleculares na proteína KIT num subtipo específico de tumores, os carcinomas adenoescamosos, que são menos frequentes, mas que possuem um comportamento bastante agressivo. Verificámos que a proteína KIT pode estar activa através de mecanismos autócrinos/parácrinos com o ligando SCF num subgrupo de tumores, apesar da ausência de alterações moleculares como mutações ou amplificação génica. Relatámos ainda que a expressão da proteína RKIP é significativamente diminuída em carcinomas do colo uterino e verificámos in vitro e in vivo que a ausência da proteína RKIP está associada a um aumento da viabilidade, migração e crescimento celular independente de ancoragem e ainda com indução de angiogénse em tumores do colo uterino. Relativamente aos gliomas, descrevemos a co-expressão de PDGFA e PDGFRA e sugerimos que a amplificação do gene PDGFRA, ao invés de mutação, pode ser o mecanismo genético subjacente à sobre-expressão de PDGFRA nestes tumores. Estes resultados levaram-nos a pesquisar a eficácia in vitro de terapias anti-PDGFRA nestes tumores. Num painel de linhas celulares de glioma verificámos que o cediranib (Rencentin®, Astrazeneca), quando comparado a outros inibidores como o imatinib ou sunitinib (Sutent®, Pfizer), constitui uma opção eficaz para o tratamento destes doentes. Adicionalmente, mostrámos que em gliomas os fármacos cediranib e sunitinib actuam em alvos distintos dos que estão descritos. Finalmente, e de acordo com os achados em GISTs e colo-uterino, observámos que a proteína RKIP está sob-expressa em gliomas e a sua ausência associada a um fenótipo maligno, constituindo ainda um marcador independente de prognóstico em doentes com glioma. Em conclusão, esta tese sugere que o rastreio de alterações em RTKs e na via das MAPKs deve ser feita para cada tipo de tumoral específico. A descoberta de novos alvos para os fármacos cediranib e sunitinib em gliomas constitui uma esperança para a identificação de novos potenciais biomarcadores preditivos da resposta a este tipo de terapias. Assim, mesmo sabendo que há ainda um longo caminho a percorrer, os resultados apresentados nesta tese poderão ajudar no desenho de terapias moleculares dirigidas para estes doentes.