Análise funcional de uma mutação missense no gene IDS associada a alterações de splicing

Abstract

O splicing do pré-mRNA é uma etapa essencial na expressão dos genes eucarióticos. Sabe-se actualmente que entre 15% a 60% das mutações exónicas ou intrónicas envolvidas em doença provocam alterações no processo de splicing. Neste trabalho, para efectuar a análise funcional da mutação c.257C>T no processo de splicing do exão 3 do gene IDS, foi utilizada uma amostra de DNA genómico de um doente diagnosticado com Mucopolissacaridose tipo II. Uma análise prévia do cDNA deste doente permitiu observar a ocorrência de dois transcritos na presença desta mutação. Um deles apresentou-se como um produto normal, apenas com a substituição C>T e origina uma proteína com a substituição aminoacídica P86L. No segundo transcrito observou-se a deleção dos primeiros 44 nucleótidos do exão 3, dado que, em vez do 3’ss normal foi utilizado um local críptico de splicing no interior do exão 3. Este local possui um valor de score mais elevado do que o local de splicing normal, sugerindo que a utilização deste estará possivelmente dependente de elementos cis-acting e/ou factores trans-acting. De facto, as análises bioinformáticas efectuadas previram alterações em motivos de ligação para as proteínas ASF/SF2, SC35 e hnRNP E1 e E2. Deste modo, no sentido de identificar quais os elementos/factores envolvidos na regulação do splicing desta região do exão 3 do gene IDS foi efectuada a construção de um minigene através da clonagem de um fragmento de gDNA do doente contendo parte do intrão 1, o exão 2, o intrão 2, o exão 3 e parte do intrão 3. O estudo in vivo deste minigene em células DT-1 permitiu verificar que o splicing ocorreu da mesma forma que no doente, sugerindo que este constructo é um sistema válido para futuramente se efectuar o estudo dos elementos cis-acting e factores trans-acting envolvidos na regulação do splicing desta região do gene IDS. Assim, a validação deste minigene permite concluir que a técnica de clonagem e construção de minigenes foi implementada com sucesso no grupo de investigação em doenças lisossomais de sobrecarga do CGM-INSA, abrindo ainda a possibilidade de continuar a efectuar estudos funcionais que contribuam para o conhecimento dos mecanismos de splicing e de delinear novas abordagens terapêuticas nesta área.

Pre-mRNA splicing is a critical step for eukaryotic gene expression. Actually it is known that 15% to 60% of disease-causing exonic or intronic mutations affect splicing. In this study, to perform splicing functional analysis of c.257C>T mutation at exon 3 of IDS gene, a genomic DNA sample from a Mucopolyssacharidose II patient was used. A preliminary analysis from patient cDNA allowed us to observe two transcripts. The first one showed only the C>T change which gives rise to a protein with the aminoacidic substitution P86L. The second one presented the deletion of the first 44 nucleotides of exon 3. This deletion was caused by the mentioned mutation which activates the use of an alternative downstream cryptic splice-site. This splice-site showed a higher score value than the constitutive splice-site, suggesting that this region is possibly under regulation of splicing cis-acting elements and/or trans-acting factors. In fact, bioinformatic analysis predicted the mutation to change ASF/SF2, SC35 and hnRNP E1 and E2 splicing factors binding sites. So, in order to identify the elements/factors involved in IDS gene exon 3 splicing regulation, a minigene was constructed with the interest gDNA fragment enclosing part of intron 1, exon 2, intron 2, exon 3 and part of intron 3. The minigene in vivo splicing analysis performed in a DT-1 cell line has shown the same splicing pattern observed in the patient, suggesting that this construct is a valid system for future studies of cis-acting elements and trans-acting factors implicated in IDS gene exon 3 splicing regulation. As a result, minigene validation allow to conclude that cloning and minigene construction technique was successfully implemented in CGM-INSA lysosomal storage disorders research group, opening therefore the potential for further functional studies which can contribute to improve knowledge of general splicing mechanisms and to design new therapeutic strategies in this area.