Influence of a quaternary ammonium compound on the cell structure of bacteria using atomic force microscopy

Abstract

Bacterial adhesion and subsequent biofilm formation remains a serious concern, especially in clinical applications, since bacteria associated with biofilms are more resistant to antibiotic treatment and to the host immune system. A potential approach to deal with this drawback may rely on the use of antimicrobial coatings comprising quaternary ammonium compounds (QACs). The main purpose of the present thesis was to study the efficacy of a QAC against staphylococci when compared with two other antimicrobial compounds, an antibiotic (Gentamicin) and an antimicrobial peptide (Gramicidin S) using atomic force microscopy (AFM). After assessing the antimicrobial activity of the compounds against planktonic cultures by determining their minimal inhibitory (MIC) and minimal bactericidal concentrations (MBC), adhering staphylococcal cells were exposed to the antimicrobial compounds and their cell surfaces analyzed with AFM. The number of bacteria removed by the AFM tip was determined and taken as an indication of cell surface damage. The antimicrobial action of the compounds on staphylococcal biofilms was evaluated by the determination of the metabolic activity of biofilm through an 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay. Finally, in order to get some insights about QAC mode of action against bacterial cells, its antimicrobial activity in planktonic cultures, as well as their effects on adhering staphylococcal cells by AFM were performed in the presence of calcium ions. All the antimicrobial compounds proved to exhibit antimicrobial activity against staphylococcal planktonic cultures. AFM measurements allowed the analysis in situ of the bacterial cells behaviour when exposed to antimicrobial compounds. Bacterial cell surface wrinkled upon exposure to the antimicrobials until bacteria disappear from the surface. Gentamicin yielded faster wrinkling and removal of bacteria from the surface as compared to QAC and Gramicidin S which yielded similar results. As the staphylococci outside the continuously scanned area did not seem affected by the compounds it was suggested that the pressure of the AFM tip assisted the incorporation of antimicrobials in the membrane, enhancing their bactericidal efficacy. Staphylococci biofilm proved to be susceptible to all the antimicrobials, with QAC being the most effective one, causing a complete loss of metabolic activity at 2xMBC. The antimicrobial action of the QAC was compromised by the presence of calcium ions both in planktonic cultures and in adhering staphylococci which suggests that its mode of action relies on its ability to exchange with calcium ions that are responsible for membrane stability.

A adesão bacteriana e consequente formação de biofilmes constitui um problema sério, sobretudo na área clínica, visto que as bactérias associadas em biofilmes são menos susceptíveis à terapia antibiótica e à acção do sistema imunitário. Uma potencial estratégia para lidar com este problema consiste no uso de revestimentos antimicrobianos constituídos por compostos quaternários de amónio (QACs). A presente tese teve como principal objectivo o estudo da eficácia de um QAC sobre uma estirpe bacteriana do género estafilococos quando comparado com outros dois compostos antimicrobianos, um antibiótico (Gentamicina) e um péptido antimicrobiano (Gramicidina S). Depois de avaliada a actividade antimicrobiana dos compostos em culturas planctónicas através da determinação da concentração mínima inibitória (MIC) e da concentração mínima bactericida (MBC), as bactérias aderidas a uma superfície foram expostas aos compostos e a sua superfície celular foi analisada por AFM. O número de bactérias removidas pela ponta do AFM foi determinado e considerado como uma indicação dos danos causados na superfície celular. A susceptibilidade dos biofilmes aos compostos foi avaliada pela determinação da actividade metabólica do biofilme através de um ensaio de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5 difeniltatrazólio de brometo (MTT). Finalmente, com o intuito de investigar o modo de acção do QAC sobre as células bacterianas, a sua actividade antimicrobiana, bem como os seus efeitos nas células aderidas e analisados por AFM foram realizados na presença de iões de cálcio. Todos os compostos exibiram actividade antimicrobiana no estado planctónico. O efeito dos compostos sobre as células bacterianas foi analisado in situ com o AFM. A superfície celular apresentou-se mais enrugada depois de exposta aos compostos até as bactérias serem removidas da superfície. A Gentamicina resultou numa remoção mais rápida que o QAC e a Gramicidina S que exibiram resultados semelhantes. Como as bactérias localizadas fora da área continuamente analisada pelo AFM não foram igualmente influenciadas pelos compostos foi colocada a hipótese de que a pressão da ponta do AFM auxiliou a incorporação dos compostos na membrana, melhorando assim a sua eficácia bactericida. O biofilme formado pela estirpe estudada na presente tese apresentou-se susceptível a todos os compostos antimicrobianos, sendo o QAC o mais eficaz ao provocar uma redução completa da actividade metabólica do biofilme a 2xMBC. A acção antimicrobiana do QAC foi comprometida pela presença de iões de cálcio o que sugere que o seu modo de acção depende da sua capacidade de substituir estes iões na membrana.