Microbial metabolites: discovery and characterization

Abstract

For decades, research on the discovery of novel antibiotic molecules and targets has been declining. Many pharmaceutical companies have abandoned this topic, turning their focus to areas were investment is more likely to translate into higher returns. As a consequence, in the past decades very few novel antibiotics have been introduced for clinical use. At the same time, the percentage of bacterial clinical isolates exhibiting resistance towards one - and many times several - antibiotics is increasing. Bacteria have devised methods of impressive diversity to avoid the detrimental effect of antimicrobial therapeutics. Even more impressive and dangerous, is the fact that many of these survival techniques, such as antibiotic-degrading enzymes and efflux pumps, are encoded by genes in mobile elements, allowing for horizontal transfer even between less related species. For my thesis work, I decided to go back to what has proven to be a consistent supply of highly effective antimicrobial molecules: microorganisms themselves. Researchers have historically turned to nature and living beings to find bioactive molecules. These molecules are not only active against bacterial pathogens, but are also effective against a wide range of pathologies, such as cancer and immunosuppressive diseases. To identify potential molecule-producing organisms, we sampled a dairy processing plant, which had been previously submitted to a daily cleaning treatment and harbored characteristic locations of low or high temperature. Crevices and dead-end zones of devices are more vulnerable to colonization by bacteria, thus the holding cell, cold storage tank, pasteurizer and storage tank - transfer pump junction were sampled. Bacteria were isolated, identified, biochemically characterized, and screened for the secretion of molecules with antimicrobial activity against Gram-negative (Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli) and Gram-positive bacteria (Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus). A subset of these organisms were also assayed for the capacity of their secreted compounds to impair bacterial adhesion and remove biofilms. Some were positive for both assays. While many isolates had biofilm inhibitory activity and produced antimicrobial compounds, we focused the remainder of the work on a single isolate, Serratia V4, due to the high antimicrobial potential of its secreted molecules. By building a random transposon mutant library of Serratia V4 it was possible to identify genes involved in the biosynthesis of the antimicrobial, a nonribosomal peptide-polyketide hybrid molecule. This information, coupled with a genome sequence, subsequently allowed us to characterize its complete and novel biosynthetic gene cluster which appears to span 52,714 base pairs. Optimization of culture conditions led to higher yields of this potent antimicrobial. After its purification, the analysis of its mass by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) and fragmentation pattern by electron-impact mass spectrometry (EI-MS) allowed us to classify it as being Zeamine, a broad-spectrum antimicrobial also secreted by the plant pathogen, Dickeyae zeae. Another class of molecules, iron chelators termed siderophores, have been found to be directly related with the capacity of some bacterial species like Vibrio anguillarum and Pseudomonas aeruginosa, to effectively colonize the human body and cause disease (virulence). Therefore, we also screened the isolate Serratia V4 for the secretion of siderophores. As a result of this screening, we identified a novel siderophore which we have named Serrabactin. In collaboration with chemists, the molecular structure of Serrabactin was solved. Serrabactin is a nonribosomal peptide which coordinates iron using three pairs of ligands. One of the iron-binding ligand pairs is novel, since it involves a free amine and the carbonyl oxygen from the amide, in addition to the typical catechol groups. The unique structure of this compound gave us clues as to the biosynthetic genes required for its synthesis, which we have now characterized. Its biosynthesis involves the coordinated action of two independent gene clusters: one analogous to that of the siderophore enterobactin and another one analogous to the biosynthetic gene cluster of the siderophore vibriobactin. In conclusion, this Serratia isolate was found to produce and secrete at least two interesting molecules with independent activities: a potentially important antimicrobial and a novel siderophore with the capacity to bind iron in an atypical way. Both of these molecules are synthesized independently of the ribosome, by NRP and/or PK synthetases and the siderophore is unusually encoded by the joint action of two independent gene clusters.

Desde há várias décadas tem sido observado um declínio do investimento na pesquisa e desenvolvimento de novos antibióticos e alvos moleculares terapêuticos. Um grande números de empresas farmacêuticas redireccionaram a sua atenção para outras áreas da investigação científica, com um suposto maior potencial de retorno do investimento e lucros. Como tal, nas últimas décadas apenas um número reduzido de novos antibióticos foi introduzido no mercado. Concomitantemente, tem-se verificado um aumento crescente da percentagem de isolados clínicos bacterianos capazes de resistir a um - e muitas vezes a vários - antibióticos. As bactérias têm-se revelado capazes de desenvolver uma panóplia impressionante de processos para contornar o efeito prejudicial dos antibióticos. Ainda mais impressionante e problemático é o facto de muitas destas estratégias de sobrevivência - como bombas de efluxo e enzimas de degradação de antibióticos - são codificadas por genes em elementos genéticos móveis. Como tal, há a possibilidade de transferência destes genes entre espécies, mesmo de géneros diferentes. No âmbito do trabalho da minha tese de doutoramento, decidi voltar a uma das fontes comprovadas de moléculas de cariz antibacteriano de alta eficácia: as próprias bactérias. Investigadores têm-se voltado para a natureza e organismos vivos da mais diversa complexidade em busca de moléculas bioactivas. Estas moléculas têm-se revelado detentoras de uma elevada diversidade e eficiência terapêuticas, tratando desde cancro a doenças imunosupressoras. Para obter e identificar microorganismos com o potencial de produzir moléculas de cariz antimicrobiano, amostrámos uma indústria de lacticínios. Os locais analisados tinham sido submetidos a tratamentos rotineiros de limpeza e temperaturas altas e baixas. Dada a propensão de zonas cegas e fissuras à colonização por microorganismos, e à sua difícil limpeza, quatro destas foram seleccionados para amostragem: célula holding, tanque de armazenamento, pasteurizador e ligação tanque de armazenamento - bomba de trasfega. Bactérias presentes nas amostras foram isoladas, identificadas, caracterizadas bioquimicamente e testadas relativamente à capacidade de segregar moléculas contra bactérias Gram-negativas (Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli) e Gram-positivas (Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus). Alguns destes isolados foram também analisados relativamente à capacidade de secreção de compostos que inibem a adesão celular e promovem a remoção de biofilmes. Alguns dos isolados apresentaram resultados positivos para todos estes testes. A restante parte do trabalho focou-se num só isolado, Serratia V4, que se evidenciou pela capacidade de segregar compostos de elevado potencial antibacteriano. A construção de uma biblioteca de mutantes aleatórios de V4, por transposões, permitiu a identificação de genes envolvidos na biosíntese do antimicrobiano. Tal permitiu comprender tratar-se de uma molécula híbrida poliquétido - péptido não-ribossómico. Esta informação, aliada à sequência genómica do isolado, possibilitou a caracterização completa do cluster envolvido na biossíntese desta molécula, que se crê cobrir um total de 52,714 pares de base. O aumento dos níveis de produção de antimicrobiano por Serratia V4 foi conseguido graças à optimização das condições de incubação e da composição do meio de cultura. Após purificação do composto, a sua massa foi determinada por espectrometria de massa de ionização por electrospray (ESI-MS). O seu padrão de fragmentação foi elucidado por espectrometria de massa de impacto electrónico (EI-MS). Estes dados, obtidos graças à colaboração com um grupo de químicos, permitiram classificar o antimicrobiano como Zeamina, um antibiótico de largo espectro segregado por Dickeyae zeae, uma bactéria fitopatogénica. Uma outra classe de compostos quelantes de ferro - sideróforos - foi descrita como estando directamente relacionada com a virulência de algumas bactérias, como Vibrio anguillarum e Pseudomonas aeruginosa. Tal deve-se ao facto de permitirem uma colonização eficaz do corpo humano pelo fornecimento de iões ferro. Dada a relevância clínica destas moléculas, também se procedeu à análise de Serratia V4 para a secreção de sideróforos. Como resultado desta análise, identificámos um novo sideróforo a que chamámos Serrabactina. A sua estrutura foi determinada graça à colaboração com um grupo de químicos. Serrabactina é um péptido nãoribossómico que coordena ferro através de três pares de ligandos. Para além de dois pares de ligandos tradicionais, dos catecóis, foi também identificado um ligando inovador que utiliza um grupo amina livre e o oxigénio do grupo carbonil de uma amida. A estructura particular deste sideróforo permitiu a inferência de genes envolvidos, que por sua vez levou à caracterização completa dos clusters de genes envolvido na biossíntese do composto. A biossíntese de Serrabactina envolve a acção coordenada de dois clusters de genes, independentes: um análogo ao cluster responsável pela biossíntese de enterobactina e um cluster adicional responsável pela síntese de vibriobactina. Assim, o isolado de Serratia seleccionado produz e segrega pelo menos duas moléculas de particular interesse, com actividades independentes: um antibiótico potencialmente importante e um sideróforo inovador com a capacidade de quelar ferro de um modo atípico. Ambas as moléculas são sintetizadas independentemente do ribossoma, por sintetases peptídicas não-ribossómicas e/ou sintetases de poliquétidos. Para além disso, o sideróforo é codificado de um modo raro que envolve a acção conjunta de dois clusters biossintéticos independentes.