Study of the role of ceramide in acetate-induced cell death in colorectal carcinoma cell lines

Abstract

Colorectal carcinoma (CRC) has one of the highest incidences and mortality on the modern society, but a growing impact on less developed and economically transitioning nations. Prevention, surgery and radio/chemotherapy are the principal approaches to overcome the disease. Finding new efficient/specific treatments in CRC, better tolerated by patients is mandatory. News strategies to be used against colorectal cancer emerged when it was found that certain strains of Propionibacterium could protect against CRC. Those bacteria, living in the human intestine, produce short-chain fatty acids (SCFAs), namely acetate, butyrate and propionate that are able to induce apoptosis specifically on CRC cells. The mechanisms behind these occurrences are not fully understood. Ceramide is an important signalling molecule, vital in cellular processes and may play a role in regulation of apoptosis in CRC cells. Previous research executed by our laboratory showed that acetate-induced apoptosis in CRC cell lines and lysosome membrane permeabilization (LMP) with cathepsin D release. The fact that ceramide promotes LMP and activates cathepsin D, led us to hypothesize that ceramide might be generated in response to acetate and thus mediate apoptosis induced by this lethal stimulus, in CRC cells. The main objective of the project was to assess the involvement of ceramide in acetateinduced apoptosis on CRC derived cell lines (HCT-15 and RKO). In order to reach that goal, cells were treated with acetate and/or inhibitors of the ceramide biosynthesis pathways (GW4869, fumonisin B1 and myriocin) and cellular viability was analysed by MTT assay. The inhibition of the three major pathways of ceramide generation (de novo, salvage and sphingomyelinase pathways) did not change significantly the cellular viability, on both cell lines. Indeed the expected increase in cellular viability did not occur when cells were treated with acetate and one or more inhibitors of ceramide synthesis pathways. Further studies are necessary to confirm the results obtained, namely determining ceramide cellular levels, and the activity of enzymes involved in ceramide synthesis treated with acetate and/or ceramide inhibitors. Summing up, the results obtained so far suggest that acetate-induced cell death in HCT- 15 and RKO CRC cells might not be mediated by ceramide.

O carcinoma colo-rectal (CCR) tem uma das maiores incidências e mortalidade na sociedade moderna, mas um impacto crescente em países menos desenvolvidos e em vias de desenvolvimento. A prevenção, cirurgia e a rádio/quimioterapia são as principais abordagens usadas no combate à doença. É importante encontrar novos tratamentos mais eficazes, específicos e melhor suportados pelos pacientes. Novas estratégias para serem usadas contra o CCR surgiram aquando da descoberta de que algumas estirpes do género Propionibacterium poderiam fornecer proteção contra o CCR. Essas bactérias, que vivem no intestino do Homem, produzem ácidos gordos de cadeia curta, como o acetato, o butirato e o propionato, que são capazes de induzir a apoptose específica das células do CCR. Os mecanismos que levam a essas ocorrências não estão bem compreendidos. A ceramida é uma molécula de sinalização importante e vital em processos celulares, e poderá desempenhar um papel na regulação da apoptose em células de CCR. Investigação prévia do nosso laboratório, mostrou que o acetato induz apoptose em linhas de CCR, bem como a permeabilização da membrana lisossomal (PML) com libertação de catepsina D. O facto de se saber que a ceramida promove a PML e activa a catepsina D, levou-nos a colocar a hipótese de que a ceramida poderia ser gerada em resposta ao acetato e poderia mediar a apoptose induzida por esse estímulo letal, em células do CCR. O principal objectivo do projeto foi avaliar o envolvimento da ceramida na apoptose induzida pelo acetato, em células do CCR (HCT-15 e RKO). Para atingir essa meta, as células foram tratadas com acetato e um ou mais inibidores das vias de síntese da ceramida (GW4869, fumonisin B1 e myriocin) e a viabilidade celular foi analisada recorrendo a ensaios de MTT. A inibição das três principais vias de produção de ceramida (de novo, selvagem e das esfingomielinases) não alterou significativamente a viabilidade celular em ambas as linhas celulares. De facto, o esperado aumento na viabilidade celular não ocorreu quando as células foram tratadas com acetato e com um ou mais inibidores das vias de síntese da ceramida. Mais estudos são necessários para confirmar os resultados obtidos, nomeadamente a determinação dos níveis celulares da ceramida e a actividade de enzimas envolvidas na síntese da mesma em células tratadas com acetato e um ou mais inibidores das vias de síntese da ceramida. Resumindo, os resultados obtidos até agora sugerem que a morte celular induzida pelo acetato em células HCT-15 e RKO de CCR parece não ser mediada pela ceramida.