3D functionalized multi-supportive structures (FMSS): a novel route for spinal cord injury regeneration

Abstract

Uma lesão do sistema nervoso acarreta normalmente consequências devastadoras. No caso particular de lesões da medula espinal (LME), os pacientes têm que lidar com múltiplas insuficiências biológicas. Por este motivo, é urgente desenvolver terapias que possam resolver eficazmente este problema. Diferentes estratégias têm sido propostas para tratar esta condição, tais como, terapias baseadas em transplantação celular e/ou terapias moleculares. No entanto, os resultados não têm sido satisfatórios, reforçando a ideia que são necessárias abordagens alternativas. A engenharia de tecidos tem sido proposta como um novo método para enfrentar estes problemas. Esta estratégia implica o uso de uma estrutura 3D que é capaz de suportar o crescimento e a diferenciação celular de forma a criar um ambiente adequado para o desenvolvimento de um tecido funcional. Tendo por base os conceitos da engenharia de tecidos, o principal objectivo do trabalho descrito nesta tese foi o desenvolvimento de um sistema que possa ser aplicado facilmente e eficazmente no tratamento de LME. Neste trabalho, o polímero natural de poli-caprolactona de amido (SPCL) foi processado por prototipagem rápida de forma a criar estruturas tubulares porosas. Seguidamente, o interior das estruturas de SPCL foram preenchidos com o hidrogel gellan gum de forma a criar uma estrutura híbrida. Neste sistema, o SPCL tem como objectivo mimetizar as funções do osso vertebral. Por sua vez, o hidrogel tem como objectivo servir como um sistema de encapsulamento celular de forma a suportar a regeneração nervosa. As estruturas desenvolvidas possuem espessura, orientação e geometria do poro e características mecânicas configuráveis. Adicionalmente, as cytotoxic behavior and allowed the in vitro culturing of oligodendrocytes, olfactory ensheathing cells (OECs) and Schwann cells for periods up to three weeks. In order to overcome some of the drawbacks associated with the use of gellan gum, namely the absence of biological signals for cellular adhesion and proliferation, this hydrogel was chemically conjugated with the peptide sequence GRGDS, via Diels-Alder click chemistry. It was observed that the novel GRGDS-gellan gum had a profound effect on neural stem cell morphology and proliferation. These results demonstrated the importance of GRGDS for cell-gellan gum interaction. Subsequently, the in vivo experiments revealed that hybrid structures are biocompatible. However, more importantly, in vivo tests showed that SPCL are suitable structures to promote spine stabilization and that the stabilization of SCI rats was associated with functional motor recovery. Finally, in the scope of this thesis, it was also assessed the effects of OECs secretome on the growth of adult stem cells derived from adipose, bone marrow, umbilical cord and nervous tissue. Results revealed that OECs secretome increase the metabolic activity and/or proliferation of these adult stem cells. As a concluding remark, it can be stated that the work described in this thesis brings new knowledge to the cell biology, biomaterial and spinal cord injury fields. The results obtained in the in vivo experiments indicate that researchers currently testing treatments for SCI repair might have to take into account the use of spine stabilization in combination with their approaches. From the biomaterial point of view, the simplicity and broad applicability of the Diels-Alder click chemistry (used to functionalize the gellan gum) can be easily extended to other molecules to further improve this material. Finally, important understanding was herein created about biological/molecular interactions between OECs and adult stem cells from several origins.

Uma lesão do sistema nervoso acarreta normalmente consequências devastadoras. No caso particular de lesões da medula espinal (LME), os pacientes têm que lidar com múltiplas insuficiências biológicas. Por este motivo, é urgente desenvolver terapias que possam resolver eficazmente este problema. Diferentes estratégias têm sido propostas para tratar esta condição, tais como, terapias baseadas em transplantação celular e/ou terapias moleculares. No entanto, os resultados não têm sido satisfatórios, reforçando a ideia que são necessárias abordagens alternativas. A engenharia de tecidos tem sido proposta como um novo método para enfrentar estes problemas. Esta estratégia implica o uso de uma estrutura 3D que é capaz de suportar o crescimento e a diferenciação celular de forma a criar um ambiente adequado para o desenvolvimento de um tecido funcional. Tendo por base os conceitos da engenharia de tecidos, o principal objectivo do trabalho descrito nesta tese foi o desenvolvimento de um sistema que possa ser aplicado facilmente e eficazmente no tratamento de LME. Neste trabalho, o polímero natural de poli-caprolactona de amido (SPCL) foi processado por prototipagem rápida de forma a criar estruturas tubulares porosas. Seguidamente, o interior das estruturas de SPCL foram preenchidos com o hidrogel gellan gum de forma a criar uma estrutura híbrida. Neste sistema, o SPCL tem como objectivo mimetizar as funções do osso vertebral. Por sua vez, o hidrogel tem como objectivo servir como um sistema de encapsulamento celular de forma a suportar a regeneração nervosa. As estruturas desenvolvidas possuem espessura, orientação e geometria do poro e características mecânicas configuráveis. Adicionalmente, as estruturas apresentaram um comportamento não tóxico e permitiram o crescimento in vitro de oligodendrócitos, células do bolbo olfactivo (OECs) e células de Schwann. De forma a ultrapassar algumas das desvantagens do gellan gum, nomeadamente o facto de este material não possuir na sua estrutura sinais biológicos, este material foi modificado com o péptido GRGDS. Foi observado que o GRGDS-gellan gum tem um forte efeito na morfologia e proliferação de células estaminais neuronais. Estes resultados demonstraram a importância do péptido GRGDS na interacção célula-gellan gum. Seguidamente, as experiencias in vivo revelaram que estas estruturas são biocompatíveis, mas, mais importante, os testes em animais demostraram que as estruturas de SPCL permitem a eficaz estabilização da coluna vertebral e que esta estabilização promove a recuperação da função motora de ratos com LME. Finalmente, no âmbito do trabalho descrito nesta tese, foi também estudado o efeito que os factores secretados pelas OECs exercem sobre a proliferação e/ou actividade metabólica de células estaminais adultas derivadas do tecido adiposo, da medula óssea, do cordão umbilical e do tecido nervoso. Os resultados revelaram que as OECs produzem factores que promovem o aumento da actividade metabólica e/ou proliferação dessas células estaminais adultas. O trabalho descrito nesta tese originou novo conhecimento para as áreas de biologia, de biomateriais e de regeneração de LME. As experiências in vivo revelaram que os investigadores que estejam actualmente a testar terapias para LME devem ter em conta a estabilização vertebral. Do ponto de vista dos biomateriais, a modificação do gellan gum é simples e de ampla aplicabilidade. Neste sentido, o gellan gum pode agora ser facilmente modificado com diferentes moléculas consoante a aplicação desejada. Finalmente, o entendimento sobre o efeito dos factores produzidos pelas OECs em células estaminais, poderá revelar-se importante para futuras terapias celulares.