Expression of colorectal cancer metabolic and angiogenic markers: association with clinicopathological characteristics and impact on prognosis

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is one of the most common cancers and a leading cause of cancer death worldwide. Several features are common to all cancers, but particularly two aroused of interest to us, namely the capacity of tumour cells to reprogram their energy metabolism and inducing angiogenesis. Therefore, the objective of this study was to understand the role of metabolic and angiogenic markers in CRC, by studying their expression and establish possible correlations with clinicopathological data. To achieve these goals we created a prospective database of CRC patients treated at Braga Hospital in the period 2005-2010, with clinical, pathological and follow-up data. From surgical specimens of CRC patients submitted to surgical treatment, Tissue Microarrays were constructed for subsequent immunohistochemical evaluation. The metabolic markers selected were the Monocarboxylate Transporter (MCTs), particularly MCT1 and MCT4 essential for lactate transport across the plasma membrane, so contributing for intracellular homeostasia. To better characterize the role of MCTs in CRC metabolism we also evaluated the expression of the chaperones CD147 and CD44 and the glycolytic marker GLUT1. The angiogenic markers selected were members of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) family: VEGF-A, VEGF-C and the receptors VEGFR-2 and VEGFR-3 with functions of angiogenesis and lymphangiogenesis. The expression of metabolic markers on CRC Hepatic metastasis was also evaluated in order to assess whether the metabolic profile of CRC was maintained by the metastatic cells. In CRC series and CRC Hepatic metastasis series, the correlation with clinicopathological data and survival curves were evaluated to assess their potential as prognostic biomarkers. The epidemiological results allowed a better knowledge of our population, since CRC epidemiological data are scarce in Portugal. Our results, consistent to that observed in the literature, clearly demonstrated that CRC is a major problem of public health and that our population can be considered a high-risk population for CRC development. We have demonstrated that the metabolic markers are overexpressed in human CRC samples, when compared with normal adjacent tissues and the same expression pattern was observed in CRC Hepatic Metastasis. Also, analysis of the association between expression of the MCT isoforms and chaperones and GLUT1 in CRC and CRC Hepatic Metastasis, demonstrated that tumour MCT1 positive cases were associated with CD147 plasma membrane expression and between MCT4 and CD147, CD44 and GLUT1. Also, CRC Hepatic Metastasis holds the same metabolic profile alterations documented in CRC tissues for MCT4 positive cases. Thus, we can conclude that these metabolic markers contribute to the malignant phenotype of CRC and this phenotype persists in Hepatic Metastasis. Overexpression of these markers in CRC, compared to normal adjacent cells, places them as potential therapeutic targets in CRC and especially in metastatic CRC as most of these proteins were not expressed on normal adjacent tissue. When analyzing correlations of these markers with epidemiological data we documented associations with parameters that reflect a worse prognosis, reflecting the metabolic advantage that these tumour cells have acquired, documented by the survival curves of MCT1 and MCT4 with stage IV and stage III, respectively, for colon cancer. Assessing the expression of angiogenic markers in CRC series, we observed that all molecules were overexpressed, reflecting their role in tumour development and progression. When we compared CRC tissue and normal adjacent tissue we observed a statistically significant correlation for VEGF-C and a tendency for correlation with VEGFR-2, so contributing for tumour grow and tumour metastization. Expression of these markers in normal adjacent cells was less pronounced for VEGFR-3 than the remaining proteins, making VEGFR-3 an attractive therapeutic target since the lower expression in normal tissues will be associated to fewer side effects. When we evaluated the correlation of these markers with epidemiological data, we found correlations with tumour characteristics that contribute to progression, invasion, metastasis and poorer prognosis, documented by the overall-survival curves of VEGF-C and VEGFR-3 with stage III and stage IV for rectal cancer. In conclusion, the results observed in this thesis, in addition to documenting the metabolic and angiogenic gain of CRC cells compared to normal adjacent cells thereby contributing to proliferative advantage and metastization capacity, also document that the presence of this metabolic and angiogenic markers are associated with tumour characteristics that reflects a worse prognosis and so worse patient survival. Altogether, these findings support their role as biomarkers and potential therapeutic targets in CRC and metastatic CRC.

O Cancro Colorectal (CCR) é um dos tumores mais frequentes, assim, como uma das principais causas de morte por doença neoplásica, a nível mundial. Várias características são comuns a todos os cancros, mas duas particularmente despertaram o nosso interesse, nomeadamente a capacidade de reprogramação do metabolismo celular e a de angiogénese. Assim, o objetivo deste estudo foi compreender o papel dos marcadores do metabolismo e de angiogénese no CCR, e, estabelecer possíveis correlações com dados clinico-patológicos. De forma a alcançar estes objetivos foi construída uma base de dados prospetiva, de doentes tratados por CCR, no Hospital de Braga, no período de 2005-2010, onde foram reunidos dados clínicos, anatomopatológicos e de follow-up. A partir dos blocos das peças cirúrgicas dos doentes operados, foram realizados “Tissue Microarrays” para posterior avaliação imunohistoquímica. Os marcadores de metabolismo selecionados foram os Transportadores de Monocarboxilatos (MCTs), nomeadamente MCT1 e MCT4, essenciais para o transporte de lactato através da membrana plasmática, contribuindo para a homeostasia intracelular. De forma a melhor caracterizar o papel dos MCTs no metabolismo do CCR também foram avaliados os chaperones CD147 e CD44 e o marcador glicolítico GLUT1. Os marcadores de angiogénese selecionados foram membros da família do Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF): VEGF-A, VEGF-C e os recetores, VEGFR-2 e VEGFR-3, com funções conhecidas em termos de angiogénese e linfangiogénese. No caso dos marcadores do metabolismo, foram também avaliadas as expressões destes marcadores numa série de Metástases Hepáticas de CRC, com o objetivo de avaliar se o perfil metabólico observado no CCR se mantinha nas respetivas metástases. Em ambas as séries, foram avaliadas as correlações destes marcadores com dados anatomopatológicos e as curvas de sobrevida, de forma a avaliar o seu potencial como marcadores biológicos. Os resultados epidemiológicos contribuíram para um melhor conhecimento da nossa população, uma vez que estes dados são escassos em Portugal. Os resultados obtidos, concordantes com os observados na literatura, demonstraram que o CCR é um problema importante de saúde pública e que a nossa população pode ser considerada uma população de altorisco para o seu desenvolvimento. Demonstramos que os marcadores metabólicos analisados estão sobre-expressos nas amostras do CCR comparativamente com o tecido normal adjacente e que o mesmo padrão de expressão foi observado nas Metástases Hepáticas de CCR. A análise da correlação da expressão das isoformas dos MCT com os chaperones e o GLUT1, na série de CCR, demonstrou que o MCT1 estava associado à expressão plasmática do CD147 e o MCT4 à expressão plasmática do CD147, CD44 e GLUT1. Na série de Metástases Hepáticas de CCR o mesmo perfil metabólico foi observado para o MCT4. Desta forma podemos concluir que estes marcadores de metabolismo contribuem para o fenótipo maligno do CCR e que este se mantem nas metástases hepáticas. A sobreexpressão destes marcadores no CCR comparativamente com o tecido normal adjacente coloca-os como potenciais alvos terapêuticos no tratamento do CCR em especial no CCR metastizado uma vez que estes marcadores não se encontram expressos no tecido normal adjacente. Ao analisarmos as correlações destes marcadores com os dados epidemiológicos documentamos a associação com características que revelam um pior prognóstico, refletindo a vantagem metabólica que estas células tumorais adquiriram, comprovada pelas curvas de sobrevida do MCT1 e MCT4 para o estadio IV e III, respetivamente, para o cancro do cólon. Avaliando a expressão dos marcadores de angiogénese, na série de CCR, observamos que todos estão sobre-expressos o que reflete o seu papel no desenvolvimento e progressão tumoral. Quando comparamos o tecido tumoral com o tecido normal adjacente observamos uma correlação para o VEGF-C e uma tendência para a correlação com o VEGFR-2, desta forma contribuindo para o crescimento e para a metastização tumoral. A expressão destes marcadores no tecido normal adjacente foi menos pronunciada para o VEGFR-3, tornando-o um alvo terapêutico atrativo, uma vez que esta menor expressão estará associada a menores efeitos secundários. Quando avaliamos a correlação com os dados epidemiológicos, encontramos correlações com características tumorais que contribuem para a progressão, metastização e pior prognóstico, documentado pelas curvas de sobrevida do VEGF-C e VEGFR-3 para o estadio III e IV, respetivamente, para o cancro do recto. Em conclusão, os resultados observados nesta tese documentam o ganho em termos metabólicos e de angiogénese das células tumorais de CCR em relação ao tecido normal adjacente, contribuindo assim para a sua vantagem proliferativa e de metastização, assim como o facto de a presença destes marcadores estar associada a características tumorais de pior prognóstico e com impacto na sobrevida dos doentes. Estes factos suportam o possível papel destes marcadores de metabolismo e angiogénese, como biomarcadores e potenciais alvos terapêuticos no CCR e CCR metastizado.