Development of a phage-based biosensor to detect Salmonella in food stuff

Abstract

Food- and waterborne illnesses are a serious public health concern worldwide and have stimulated research aiming at a rapid and accurate detection of pathogens by applying biosensing technologies. Salmonella, Campylobacter and E. coli are some examples of pathogens that have an enormous impact on public health. Many publications have mentioned different type of biosensors for a broad range of bacteria. These methods may circumvent the limitations that conventional microbiological techniques have. Pathogens of interest need culture enrichment steps to reach the detection limit, a process that requires time, as well as laboratory technicians with expertise skills. Detection of pathogens at a very early stage is not as easy as it seems, due to the necessity to unite a set of characteristics that enable the development of an inexpensive and robust biosensor. The ideal biosensing system should be rapid and accurate and should combine specificity and sensitivity, leading to a marginal amount of false positive or negative results. As the biosensor is composed of two parts, a biological and a sensor element, the biorecognition element of choice plays a crucial role when creating the perfect biosensor. Bacteriophages (or simply phages) are viruses that specifically recognize bacteria and this characteristic can be used as a potential "key" to solve problems related with bacterial detection. Moreover, the easy and low cost production of these viruses combined with their stability in harsh environmental conditions make them excellent competitors with other biological elements (e.g. antibodies, enzymes). The use of phages as a therapeutic agent and as an interface in detection systems has gained special interest of the research community. In many laboratories, phage-based platforms have been developed; however only a few have broken the barrier and went to the market as a clinical diagnostic tool. Nowadays, the food sector still uses conventional methods to detect Salmonella in food stuff that, as mentioned before, take times and requires expert skills. Notwithstanding the great improvements in the detection area, biosensing systems still lack sensitivity and give erroneous results. Furthermore, problems related to the detection of bacteria in a viable but nonculturable (VBNC) state is one of the concerns that can give false negatives. VBNC bacteria are not able to grow on standard bacteriological media, but are metabolically active, albeit very low, maintaining the capacity to cause diseases and therefore remain a potential risk in several health facilities and the food industry. The use of standard microbiological methods to detect if the bacterium is dead or alive is no practicable, since the presence of VBNC state is not detectable. Therefore, novel technologies that can overcome this barrier are imperative. The prevalence of this problem and the necessity of finding a detection technology that can fulfill the Salmonella detection needs, led to the proposal of the present work that explores phages as an interface in a magnetoresistive and magnetoelastic biosensor. The work presented herein describes the characterization of a broad host range lytic phage. PVP-SE1, is able to discriminate between cell viability states, including the VBNC condition. This phage was combined with highly sensitive magnetoresistive sensors originating a powerful detection system with highstandard performance at the accuracy, specificity but also sensitivity level, detecting bacteria concentrations in the order of 100 cells/μL (3-4 cells/sensor). Another strategy followed, aiming at circumventing the limitations of using whole phages in a biosensing interface, was the utilization of recognition peptides of phage origin, responsible for the identification of the hosts. The proof-of-concept was demonstrated with a model phage selected from landscape library as a streptavidin binder. The results showed that the streptavidin binding peptides extracted from the phage bind to streptavidin with the same or better affinity than the native phage. The same was demonstrated with the tail fibre proteins of phage PVP-SE1, heterologously expressed, which showed equal binding affinities compared to their parental phage. This work demonstrates how phages can be explored in the development of a biosensor, opening the possibility of using an accurate, sensitive, specific and cheaper device that can be applied to an emergent concern: foodborne pathogens.

As doenças transmitidas através de alimentos e água contaminada são uma preocupação mundial e têm estimulado o desenvolvimento de métodos rápidos e precisos na área dos biossensores para a deteção de agentes patogénicos. Salmonela, Campylobacter e a E. coli são exemplos de espécies bacterianas patogénicos que tem um enorme impacto na saúde pública. Atualmente já existem diferentes tipos de biossensores desenvolvidos para uma ampla variedade de bactérias, que contornam as limitações das técnicas convencionais, tais como tempo de medida, devido à amplificação do microrganismo de interesse no seu adequado meio de cultura, e pela necessidade de técnicos com competências específicas. No entanto, a deteção de agentes patogénicos não é assim tão fácil como parece devido à necessidade de combinar um conjunto de características que permita o desenvolvimento de um biossensor robusto e pouco dispendioso. Um sistema de deteção ideal deve ser rápido, preciso e combinar características como especificidade e sensibilidade, de forma a conduzir a resultados livres de falsos positivos/negativos. Como o biossensor é composto por duas partes, i.e. um elemento biológico e um sensor, o elemento biológico escolhido tem um papel crucial no momento da criação de um biossensor perfeito. Bacteriófagos (ou simplesmente fagos) são vírus que infetam especificamente bactérias podendo essa característica ser utilizada como uma “chave” para solucionar problemas relacionados com a deteção de bactérias. Para além disso, a produção simples e económica destes vírus juntamente com a sua estabilidade em condições ambientais adversas, torna-os excelentes ferramentas de deteção, podendo competir com outros elementos biológicos (e.g. anticorpos, enzimas). A sua utilização como agentes terapêuticos e como interface em sistemas de deteção tem recebido uma atenção especial por parte da comunidade científica. Muitos laboratórios têm desenvolvido plataformas de deteção à base de fagos, no entanto, somente algumas conseguiram quebrar a barreira e entrar no mercado para serem usadas como ferramenta deteção para uso clinico. Hoje em dia, indústrias alimentares ainda usam métodos convencionais para detetar Salmonela na alimentação que, tal como previamente referido, são morosas e exigem mão de obra especializada. Mesmo utilizando diversas estratégias de deteção com diferentes plataformas e bio recetores, problemas com resultados falsos positivos e negativos permanecem difíceis de resolver. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis são uma preocupação, porque estão relacionadas com resultados falsos negativos. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis, não têm capacidade de crescer em meios de cultura convencional, mas encontram-se metabolicamente ativas, conservando a sua capacidade de causar doenças e de serem um potencial perigo em várias setores da saúde e na industria alimentar. Assim, a utilização de métodos de cultura padronizados para detetar se a bactéria está viva ou morta torna-se inviável, já que a presença de bactérias num estado viável, mas não cultivável não é detetada. Portanto, novas tecnologias que possam ultrapassar essa barreira são fundamentais. A prevalência deste problema e a necessidade de encontrar uma tecnologia de deteção que possa satisfazer as necessidades de deteção da Salmonela conduziu à proposta deste trabalho que explora os fagos como uma possível interface a usar em biossensores magneto-resistivos e magneto-elásticos. O trabalho presentado aqui descreve a caracterização de um fago lítico com um amplo espectro lítico, PVP-SE1. Este fago provou capacidade em discriminar os estados de viabilidade celular incluindo o estado viável, mas não cultivável. O fago foi combinado com sensores magneto-resistivos, que têm mostrado uma elevada sensibilidade. Esta combinação originou um poderoso sistema de deteção com um padrão de desempenho elevado, quer em termos de precisão e especificidade, quer em termos de sensibilidade, detetando concentrações de bactérias na ordem de 100 células/μL (3-4 células/sensor). Uma outra estratégia adotada, tendo por objetivo contornar as limitações da utilização dos fagos inteiros numa interface de um biossensor, passou pela utilização dos recetores dos fagos responsáveis pela identificação dos hospedeiros. Como prova de conceito um fago com especificidade de ligação à streptavidin foi selecionado a partir de uma biblioteca de fagos e usado como modelo. Os resultados demonstraram que os recetores do fago ligam-se à streptavidin com a mesma ou melhor afinidade do que o fago inteiro (original). O mesmo foi demonstrado com os recetores do fago PVP-SE1, demonstrando igualmente afinidades de ligação, comparativamente, com o seu fago parental. Este trabalho demonstrou como os fagos podem ser explorados no desenvolvimento de um biossensor abrindo a possibilidade de desenvolver um dispositivo preciso, sensível, específico e económico que possa ser aplicado a uma preocupação emergente: os patogénicos de origem alimentar.