Optimization of monoclonal antibody production

Abstract

Monoclonal antibodies (mAbs), with their unique high specificity, are the most successful product of biopharmaceutical industry, with application in a number of diseases. Due to the high doses typically required, the industry is constantly pressured to develop processes of production that obtain high product yields at reduced costs. Many progresses have been made in this field, mainly due to the emergence of mammalian cell culture technology, and to developments on culture media, production systems, monitoring and scale-up techniques. Currently, the processes of mAb-production mostly rely on suspended mammalian cell culture under fully-defined conditions. These defined conditions are required by the regulatory agencies due to safety concerns over the presence of animal-components (e.g. serum) which may transmit diseases to humans. Furthermore, the preference for suspension over adherent cultures is mostly related to a higher surface-to-volume ratio that improves cell and product yields. However, alternative systems for highyield adherent cultures are now available, such as the microcarrier technology that allows cell growth in small carriers kept in suspension by gentle rocking. These systems can be advantageous by protecting cells from the shear-stress caused by rocking, a limiting factor in suspended cultures. Although different approaches are available for mammalian cell culture in production systems, there are many issues that still need to be addressed to reach an optimal process of production. In this context, the main goal of the present thesis was to increase the current knowhow about the application of less-explored technologies for mAb production. For this purpose, a mAb-producing Chinese hamster ovary cell line (CHO-K1) was used, and in a first stage adapted to grow in serum-free conditions to evaluate the impact on mAb production. The adaptation was performed using a gradual methodology and proved to be time-consuming (280 days), particularly at the stage of 0.31 % serum, due to a shift of cell growth from adherent to suspended. Also at this stage, major differences were obtained among the different combinations of supplements (trace elements) tested to support cells during adaptation. Only one of five combinations was successful, proving that the selection of supplement combination is critical. Additionally, this study has shown the importance of avoiding culture procedures that are too aggressive for cells during adaptation (e.g. centrifugation, trypsinization). Concerning mAb production (assessed by enzyme-linked immunosorbent assay), the adaptation to serum-free medium was favorable, showing 2-fold improvement over serum-supplemented culture, due to the shift from the common DMEM medium to the chemically-defined EX-CELL CHO DHFR- medium. Indeed, media selection is crucial for the success of production, so another aim of this work was to compare seven serum-free media for CHO-K1 cell growth (assessed by cell counting) and mAb production. Concerning both parameters, EX-CELL CHO DHFR- and CDM4CHO were the best media, further evidencing a tendency to improve performances over time, which favors their use in extended processes of production. This thesis also explored microcarrier technology for mAb production using adherent cells. Thus, two types of microcarriers were evaluated in different culture conditions, both providing productions superior to typical adherent and suspended cultures, particularly the microporous Cytodex 3. This carrier had cell proliferation, mAb production (2-fold), and culture longevity higher than the macroporous CultiSpher-S. The culture parameters divergently affected the microcarriers, with the most critical being rocking mechanism for Cytodex 3 and cell inoculum for CultiSpher-S. The viability of using CultiSpher-S for culturing suspended mAb-producing CHO-K1 cells in serum-free medium was also assessed and compared to common suspension cultures. The porous structure of these carriers allows the entrapment of the suspended cells and provides a potential advantage over suspension cultures by protecting cells from the shear stresses of rocking. The microcarrier culture had mAb productions similar to suspension cultures, but with a tendency to improve over time, being a good alternative for extended processes. Additionally, it was shown that the use of rocking significantly reduces mAb production, particularly using the CDM4CHO medium, which benefited by microcarrier culturing due to the protection conferred against shear stress. In opposition, the EX-CELL CHO DHFR- medium favored cell growth in common suspension cultures. In the context of shear stress, the disposable Wave bioreactor has emerged for mammalian cell culture performed under low shear conditions due to an innovative mechanism of rocking based on an undulation movement. However, mixing and flow inside this reactor still need to be characterized, motivating a study of residence time distribution under the flow conditions applied in mammalian cell culture. The Wave behavior deviated from ideal models, with no correlation to the rocking mechanism, suggesting the need to develop new models to describe its performance. In summary, the present thesis compiles important data that increase the know-how about different technologies for mAb production, contributing to the evolution into a more sustained and structured optimization that will replace the current empirical and trial-and-error practices.

Os anticorpos monoclonais (AcMs), com a sua elevada especificidade, são o produto de maior sucesso da indústria biofarmacêutica. As elevadas doses exigidas levam a uma constante pressão para desenvolver processos de produção com rendimentos elevados, a custos reduzidos. Neste sentido, têm-se observado avanços na tecnologia de células animais, desenvolvimento de meios de cultura, sistemas de produção e técnicas de monitorização e aumento de escala. Atualmente, os processos de produção de AcM baseiam-se na cultura de células animais em suspensão, sob condições definidas, como exigido pelos órgãos reguladores devido a preocupações de segurança sobre a presença de componentes de origem animal que podem transmitir doenças aos humanos. Já a preferência pela cultura em suspensão sobre a aderente deve-se à maior relação superfície-volume que permite obter maior concentração celular e de produto. No entanto, já estão disponíveis sistemas alternativos que permitem a cultura aderente com elevado rendimento, tal como a tecnologia de suportes microporosos que possibilita o crescimento de células em pequenos suportes mantidos em suspensão através de agitação suave. Estes sistemas têm a vantagem de proteger as células das possíveis tensões de corte provocadas pela agitação, fator limitante da cultura em suspensão. Embora estejam disponíveis diversos sistemas produtivos para cultura de células animais, existem muitas questões que ainda precisam de ser abordadas a fim de se atingir um processo de produção ótimo. Neste sentido, a presente tese teve como principal objetivo melhorar o atual conhecimento sobre a aplicação de tecnologias menos exploradas para a produção de AcM. Para este propósito, células do ovário de hamster chinês (CHO-K1) produtoras de AcM foram adaptadas a crescimento em meio sem soro, avaliando-se o impacto deste processo na produção de AcM. A adaptação foi realizada gradualmente, provando ser morosa (280 dias), especialmente na fase de 0,31 % soro, devido à alteração do crescimento das células do estado aderente para suspensão. Verificou-se ainda a importância de usar suplementos (oligoelementos) adequados no meio de cultura e de evitar procedimentos agressivos para as células (p.e. centrifugação, tripsinização). Relativamente à produção de AcM (avaliada por ensaio imunoenzimático), a adaptação permitiu duplicar a produção na passagem do meio DMEM suplementado com soro para o meio sem soro quimicamente definido EX-CELL CHO DHFR-. A seleção do meio de cultura é crucial num processo produtivo, tendo-se por isso comparado o efeito de sete meios sem soro no crescimento celular (contagem celular em hematocitómetro) e produção de AcM. Os meios EX-CELL CHO DHFR- e CDM4CHO proporcionaram os melhores resultados, com tendência de melhoria ao longo do tempo, sendo favoráveis para processos de produção longos. A tecnologia de suportes microporosos foi também explorada para a produção de AcM com células aderidas, tendo-se avaliado dois tipos de suportes em diferentes condições de cultura. Os suportes microporosos permitiram obter produções superiores às culturas tradicionais aderentes e em suspensão, particularmente com o Cytodex 3 microporoso. Este proporcionou proliferação celular, produção de AcM (2x maior) e longevidade da cultura superiores ao CultiSpher-S. Os resultados obtidos divergem com os parâmetros de cultura, sendo o mecanismo de agitação mais crítico no Cytodex 3 e a concentração de inóculo no CultiSpher-S. A viabilidade do uso de CultiSpher-S na cultura de CHO-K1 em suspensão e meio sem soro foi avaliada e comparada com culturas em suspensão comuns. A estrutura porosa do CultiSpher-S permite o encapsulamento das células em suspensão, podendo protege-las das tensões de corte provocadas pela agitação. Estas culturas permitiram produções de AcM semelhantes às culturas em suspensão comuns, mas com tendência de melhoria ao longo do tempo, tornando-se uma boa alternativa para processos extensos. Verificou-se ainda que a agitação diminuiu significativamente a produção, particularmente nas culturas em CDM4CHO que beneficiaram com o uso dos suportes. Já o meio EX-CELL CHO DHFR- favoreceu o crescimento celular nas culturas em suspensão comuns. No contexto das tensões de corte, o bioreator descartável Wave surgiu com um mecanismo de agitação inovador para a cultura de células animais com tensões reduzidas. No entanto, a mistura e o fluxo no seu interior ainda carecem de caracterização, motivando o estudo da distribuição do tempo de residência com fluxos da cultura de células animais. O desempenho do reator Wave afastou-se dos modelos ideais, sem correlação com o mecanismo de agitação, sugerindo a necessidade de desenvolver novos modelos para descrever o seu comportamento. Em suma, a presente tese compila uma série de dados que aumentam o conhecimento sobre diferentes tecnologias para a produção de AcM, encaminhando para um processo otimizado mais sustentado e estruturado, que irá substituir as atuais práticas empíricas e de tentativa-erro.