Impacts of nanoparticles to microbes and invertebrates: from community responses to cellular targets

Abstract

The incredible development in nanotechnology since the last decade has brought the “nanoworld” to our regular life. However, the extensive global growth in commercial production and usage of nanomaterial-based products raised the question whether nanomaterials when released to the environment can constitute a potential risk to biota and ecosystem processes. Being large reservoirs, natural waters are likely to be the ultimate sink of nanomaterials. In forested streams, microbes, predominantly fungi, decompose plant litter from riparian vegetation and transfer carbon and energy via invertebrate shredders to higher trophic levels. Freshwater decomposers are sensitive to changes in water quality with implications to ecosystem functioning. Considering the recent development of nanotechnology, assessing the potential toxicity of nanomaterials against freshwater decomposers and examining their ecological and physiological responses to nanoparticle exposure will contribute to a safer use of nanomaterials. In this study, by using a microcosm approach, we found that nanocopper oxide (nanoCuO), nanosilver, and their ionic precursors severely affected leaf litter decomposition by stream-dwelling microbes, as indicated by a decrease in microbial biomass, fungal sporulation and species richness. Moreover, the analysis of fungal and bacterial communities, based on DNA fingerprints from denaturing gradient gel electrophoresis and fungal sporulating species, revealed shifts in species composition and changes towards a better adapted community under the stress induced by nano and ionic metals. Moreover, the negative effects of metal nanoparticles were less pronounced than those of their ionic forms. Nanoparticle size (12, 50 and 80 nm) and the presence of humic acid (HA) influenced the toxicity of nanoCuO against stream-dwelling microbial decomposers. The toxicity of nanoCuO increased in a dose-dependent manner and with the decrease in nanoparticle size. Bacteria were more sensitive than fungi to nanoCuO, because EC50 values for biomass of bacteria were much lower than those of fungi. Fungal reproduction was more sensitive to nanoCuO than leaf decomposition or microbial biomass. HA alone also had negative effects on microbial diversity and activity, but the presence of HA alleviated the negative effects of smaller size nanoCuO (12 or 50 nm). Alterations in leaf surface morphology further supported the impacts of nanoparticles and HA on microbial activity on decomposing leaves, as shown by scanning electron microscopy. We also showed that nanoCuO had lethal and sublethal effects on Allogamus ligonifer, a common invertebrate shredder in Southwest European streams that prefers high quality stream water. The feeding behaviour and growth of the invertebrate were affected in a dose-dependent manner. Effects were due to both nanoCuO and ionic copper leached from nanoCuO that adsorbed or accumulated in the shredder body. The feeding behaviour of the invertebrate shredder was more inhibited as nanoparticle size decreased. The toxicity of smaller size nanoCuO to the shredder was alleviated by the presence of HA. A postexposure feeding experiment showed a very low recovery of the invertebrate feeding behaviour after stress removal. The exposure of aquatic fungal populations to nanoCuO led to a decrease in biomass production, alterations in cell-wall morphology, increased biosorption of nanoCuO and induction of extracellular laccase activity in a time and dose-dependent manner. Fungal populations from metal-polluted streams were more resistant/tolerant to the stress induced by nanoCuO than those from non-polluted streams. Differences in laccase activity among fungi appeared to be related to the presence of laccase-like genes in the copper-binding domain. Exposure to nanoCuO or ionic copper led to lower intracellular accumulation of reactive oxygen species (ROS), plasma membrane disruption, and DNA-strand breaks in fungal populations isolated from metal-polluted streams than in those from non-polluted streams. The activities of glutathione reductase and superoxide dismutase were higher in fungi from metal-polluted than from non-polluted streams, but the opposite was found for glutathione peroxidase activity. Results suggested that fungi from metal-polluted streams have higher capacity to deal with the oxidative stress induced by nanoCuO, probably due to their ability to maintain a high ratio of reduced glutathione (GSH) to oxidized glutathione (GSSG). In contrast to metal nanoparticles, polyhydroxy fullerene (PHF) nanoparticles stimulated the growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae, which was used as model of eukaryotic organism. Moreover, the oxidative stress induced by cadmium ions to yeast cells was mitigated by the presence of PHF. A maximum growth recovery was obtained after 26h of exposure to 500 ppm PHF at pH 6.8. Results suggested that PHF nanoparticles have antioxidant and free-radical scavenging properties.

Na última década ocorreu um desenvolvimento exponencial da nanotecnologia o que trouxe o "nanomundo" à nossa vida do dia a dia. No entanto, o crescimento a nível global da produção e do uso de produtos com base em nanomateriais levanta a questão de saber se os nanomateriais, quando libertados para o meio ambiente, podem constituir um risco potencial para as comunidades biológicas e para os processos dos ecossistemas a elas associados. Os ecossistemas de água doce são susceptíveis de constituir o reservatório final dos nanomateriais. Nos rios e ribeiros florestados, os microrganismos, principalmente os fungos, decompõem o material vegetal proveniente da vegetação ribeirinha e promovem a transferência do carbono e da energia para os níveis tróficos superiores através da actividade dos invertebrados trituradores. Os decompositores de água doce são sensíveis a alterações na qualidade da água, com implicações para o funcionamento do ecossistema. Assim, a avaliação da potencial toxicidade dos nanomateriais para os decompositores de água doce e a análise das suas respostas ecológicas e fisiológicas à exposição a nanopartículas contribuirá para uma utilização mais segura dos nanomateriais. Neste estudo, usando uma abordagem em microcosmos, mostrámos que as nanopartículas de óxido de cobre, as nanopartículas de prata, e os seus precursores iónicos afectavam negativamente a decomposição da folhada por comunidades de microrganismos aquáticos, como indicado por uma diminuição da biomassa microbiana (fungos e bactérias), da esporulação dos fungos e da riqueza em espécies de fungos. A análise da comunidades de fungos, por electroforese em gradiente desnaturante do DNA microbiano e com base na morfologia das conídias libertadas da folhada em decomposição, revelou alterações na estrutura das comunidades no sentido de uma comunidade melhor adaptada ao stress induzido pelos metais quer nas formas nano quer iónicas. Além disso, os efeitos negativos das nanopartículas metálicas foram menos pronunciados do que os das suas formas iónicas. O tamanho das nanopartículas de óxido de cobre (12, 50 e 80 nm) e a presença do ácido húmico (HA) influenciou a toxicidade das nanopartículas para os microrganismos decompositores. A toxicidade das nanopartículas de óxido de cobre aumentou com a dose e com a diminuição do tamanho das partículas. As bactérias foram mais sensíveis do que os fungos às nanopartículas de óxido de cobre, porque os valores de EC50 para a biomassa de bactérias foram muito mais baixos do que os dos fungos. A reprodução dos fungos foi mais sensível à exposição às nanopartículas de óxido de cobre do que a decomposição da folhada ou a biomassa microbiana. O HA sozinho também teve efeitos negativos sobre a diversidade e a actividade dos microrganismos. Contudo, a presença de HA mitigou os efeitos negativos das nanopartículas de óxido de cobre de menor tamanho (12 ou 50 nm). As alterações na morfologia da superfície da folhada, reveladas por microscopia electrónica de varrimento, corroboraram os efeitos das nanopartículas e do HA na actividade microbiana nas folhas em decomposição. Os nossos resultados também mostraram que as nanopartículas de óxido de cobre tiveram efeitos letais e subletais em Allogamus ligonifer, um invertebrado detritívoro comum em rios do Sudoeste Europeu com elevada qualidade ecológica. A presença de nanopartículas de óxido de cobre afectou o comportamento alimentar e o crescimento do invertebrado de uma forma dependente da dose. Os efeitos negativos no animal pareceram ser devidos à adsorção ou acumulação no corpo do invertebrado de nanopartículas e de cobre iónico libertado das nanopartículas. O comportamento alimentar dos invertebrados foi mais inibido na presença de nanopartículas de menor tamanho comparativamente às de maior tamanho. A toxicidade das nanopartículas de óxido de cobre de menor tamanho para o invertebrado foi atenuada pela presença de HA. Uma experiência de alimentação de pósexposição mostrou uma baixa recuperação do comportamento alimentar dos invertebrados após a remoção do stress imposto pelas nanopartículas. A exposição de populações de fungos aquáticos às nanopartículas de óxido de cobre levou a uma diminuição da biomassa produzida, a alterações na morfologia da parede celular, ao aumento da bioadsorção das nanopartículas de óxido de cobre e à indução da actividade de lacases extracelulares de uma forma dependente da dose e do tempo. As populações de fungos isoladas de rios poluídos com metais foram mais resistentes/tolerantes ao stress induzido pelas nanopartículas metálicas do que as isoladas de rios não poluídos. As diferenças observadas na actividade das lacases entre os fungos pareceram estar associadas à presença ou ausência de genes do tipo das lacases. A exposição a nanopartículas de óxido de cobre ou a cobre iónico induziu menor acumulação intracelular de espécies reactivas de oxigénio e menos danos na membrana plasmática e no DNA de fungos isolados de rios poluídos com metais do que em fungos isolados de rios não poluídos. As actividades da glutationa reductase e da superóxido dismutase foram mais elevadas em fungos isolados de rios poluídos com metais do que em fungos isolados de rios não poluídos. Contudo, o oposto foi observado para a actividade da glutationa peroxidase. Os resultados sugerem que os fungos de rios poluídos com metais têm maior capacidade para lidar com o stress oxidativo induzido pelas nanopartículas de óxido de cobre provavelmente devido à sua capacidade de manter uma razão elevada de glutationa reduzida (GSH) em relação à glutationa oxidada (GSSG) nas células. Em contraste com o observado para as nanopartículas metálicas, as nanopartículas de poli-hidroxi-fulereno (PHF) estimularam o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae, a qual foi utilizada neste trabalho como modelo de organismo eucariota. Por outro lado, o stress oxidativo induzido por iões de cádmio na levedura foi atenuado pela presença de PHF. A recuperação máxima do crescimento da levedura foi obtida após 26 horas de exposição a 500 mg L-1 de PHF e a pH 6,8. Os resultados sugerem que as nanopartículas de PHF têm propriedades antioxidantes.