Role of apoptotic regulators in the protective effect of acetic acid against ethanol - induced cell death in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Ethanol is a well-know end product of alcoholic fermentation carried by Saccharomyces cerevisiae. At relatively low concentrations it is an inhibitor of yeast growth, while, high ethanol concentrations reduces cell viability (Birch and Walker, 2000). During fermentation, acetic acid produced by yeast metabolism may accumulate in growth medium and enhance ethanol toxicity (Gibson et al., 2007). By contrast, studies conducted in our laboratory have shown that S. cerevisiae cells exposed simultaneously to toxic concentrations of ethanol and low concentrations of acetic acid displayed a higher survival than cells treated only with ethanol (Vieira et al., unpublished results). Later, Trindade showed that Hog1p and Fps1p, involved in acetic acid resistance, do not have a role in the protective effect of acetic acid seen by Vieira (Trindade, 2009). Subsequently, it was also shown that the osmolyte trehalose, the heat shock protein Hsp12p, the MAP kinase Slt2/MPK1 and functional mitochondria play a role in the protection by the undissociated form of acetic acid against ethanol induced cytotoxicity (Afonso, 2011). With the present master thesis we intended to further understand how acetic acid protects against ethanol-induced cytotoxicity, determining the role of known apoptotic regulators in this protection. We also intended to characterize the death of cells exposed to toxic concentrations of ethanol since this knowledge is important to dissect the role of acetic acid in its inhibition. This study showed that the deletion in CYC3 or ATP2, ATP10 and NUC1 abolish and decrease, respectively, the protection of acetic acid against loss of cell viability, loss of plasma membrane integrity and the accumulation of superoxide anion, induced by ethanol. Death induced by ethanol was associated with typical markers of apoptosis but also of necrosis. In particular caspase activation and exposure of phosphatidylserine was detected mainly in cells with compromised plasma membrane, but also HMGB1/Nhp6A translocates from the nucleus to the cytosol in response to ethanol. Moreover, the absence of known apoptotic regulatory proteins abrogate (atp2Δ, atp10Δ, cyc3Δ, por1Δ, cpr3Δ and yca1Δ mutants), exacerbate (aif1Δ, nuc1Δ, and cyc1Δcyc7Δ mutants) or have no effect (pep4Δ mutant) in ethanol induced cell death. Altogether the results obtained with the mutants phenotypes and the characterization of cell death markers indicate that ethanol triggers a regulated cell death process that shares features typical of both apoptosis and necrosis. Whether the necrotic features reflect a programmed necrosis or a secondary necrosis of apoptotic cells committed to death in response to ethanol, requires further studies.

O etanol é um produto final bem conhecido da fermentação alcoólica conduzida por Saccharomyces cerevisiae . Em concentrações relativamente baixas é um inibidor do crescimento da levedura, enquanto em concentrações elevadas induz perda da viabilidade celular (Birch e Walker, 2000). Durante a fermentação, o ácido acético produzido pelo metabolismo da levedura pode acumular-se no meio extracelular e aumentar a toxicidade de etanol (Gibson et al., 2007). Por outro lado, estudos realizados no nosso laboratório mostraram que células de S. cerevisiae simultaneamente expostas a concentrações tóxicas de etanol e baixas concentrações de ácido acético exibiam uma maior sobrevivência do que aquelas tratadas apenas com etanol. (Vieira et. al., resultados não publicados). Mais tarde, Trindade mostrou que as proteínas Hog1p e Fps1p, envolvidas na resistência ao ácido acético, não apresentam um papel no efeito protetor do ácido acético observado por Vieira (Trindade, 2009). Posteriormente, mostrou-se que o osmólito trealose, a proteína de choque térmico Hsp12p, a MAP quinase Slt2/MPK1 e mitocôndrias funcionais têm um papel na proteção da forma não dissociada do ácido acético contra citotoxicidade induzida por etanol (Afonso, 2011). Com a presente dissertação de mestrado pretendeu-se compreender melhor como o ácido acético protege contra a citotoxicidade induzida por etanol, determinando o papel de reguladores conhecidos da apoptose nesta proteção. Também se pretendeu caracterizar a morte de células expostas a concentrações tóxicas de etanol uma vez que este conhecimento é importante para dissecar o papel do ácido acético, na sua inibição. Este estudo mostrou que a ausência dos genes CYC3 ou ATP2, ATP10 e NUC1 elimina e diminui, respetivamente, a proteção do ácido acético contra a perda induzida pelo etanol da viabilidade celular, da integridade da membrana plasmática e da acumulação de anião superóxido. A morte induzida pelo etanol foi acompanhada de marcadores celulares típicos de apoptose, mas também de necrose. Em particular foi detetada ativação de caspases e exposição de fosfatidilserina principalmente em células com a membrana plasmática comprometida, mas também a translocação do HMGB1/Nhp6A do núcleo para o citosol em resposta ao etanol. Adicionalmente, a ausência de reguladores apoptóticos reduziram (nos mutantes atp2Δ, atp10Δ, cyc3Δ, por1Δ, cpr3Δ e yca1Δ), potenciaram (nos mutantes aif1Δ, nuc1Δ, e cyc1Δcyc7Δ ) ou não afetaram a sobrevivência celular (no mutante pep4Δ) em resposta ao etanol. Os resultados respeitantes aos fenótipos dos mutantes estudados e à caracterização dos marcadores de morte celular indicam que o etanol induz uma morte regulada que partilha características típicas de apoptose e necrose. Se as características de necrose refletem uma necrose programada ou uma necrose secundária de células que desencadearam um processo de morte apoptótico, requer mais estudos no futuro.