Development of a multifunctional phage-based nanoparticle for targeted drug delivery

Abstract

Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women and killed more than half a million people in 2012. Classic treatments, namely chemotherapy, continue to be the backbone of cancer therapies. However, their non-specificity and non-selectivity is an open window to develop new targeted therapies that will eventually eliminate only cancer cells. The goal of this work was to develop a phage-based nanoparticle that can be used as a carrier for multiple anticarcinogenic drugs, targeting and eliminating breast cancer cells, without damaging healthy cells. Specifically, it was planned to genetically manipulate M13KE phage with encoding cell-penetrating peptides (CPPs) and specific peptides for breast cancer cells, which would allow phage internalization towards human cells. HIV-Tat and Penetratin CPPs, as wells as a specific peptide for human breast cancer cell receptors (so-called 231 peptide) were used. Moreover, coupling anticarcinogenic drugs to the phage major coat protein would result in a lower in situ drug concentration required to eliminate those cells. Doxorubicin (DOX) and PD98059 were used for that purpose owing to their synergistic effect on cancer cells death and proliferation. Several approaches herein implemented provided clear evidences that chemical conjugation of DOX to the phage was achieved. For instance, Fourier transform near-infrared spectroscopy (FT-NIRS) enabled the discrimination between free DOX or phage solutions from conjugated phages. PD98059 conjugation was not successfully accomplished mainly due to solubility issues. In vitro cytotoxicity of the phages (control and conjugated with DOX) and free DOX was assessed against tumorigenic MDA-MB-231 and non-tumorigenic MCF-10-2A cell lines. Conjugated DOX induced cytotoxicity in an independent phage-manner but, as expected, the treatment was not specific to the cancer cells. The phage genome manipulation with HIV-Tat, Penetratin and 231 peptides could not be accomplished, thus limiting the phage internalization by human cells. Parallel to this cytotoxic analysis, an image segmentation algorithm was developed, able to provide information on cell confluence, regardless of the cell morphology. As a result, the operator variability during cell culturing was reduced. In summary, the results highlight the clear need of targeted therapies for cancer treatment, as well as the potential of phages to be used as therapy platforms.

O cancro de mama é o mais frequentemente diagnosticado nas mulheres e matou mais do que meio milhão de pessoas em 2012. Os tratamentos clássicos, nomeadamente a quimioterapia, continuam a ser as terapias de eleição para o seu tratamento. Contudo, a falta de especificidade e seletividade destes tratamentos constituem uma “janela aberta” para o desenvolvimento de novas terapias que consigam, eventualmente, eliminar as células do cancro. O objetivo deste trabalho passou por desenvolver uma nanopartícula fágica, usada como vetor de fármacos anticancerígenos, capaz de reconhecer e eliminar apenas as células de cancro de mama, sem danificar as saudáveis. Especificamente, pretendia-se manipular geneticamente o fago M13KE com “cell-penetrating peptides” (CPPs), HIV-Tat e Penetratin, e também com péptidos específicos para receptores das células do cancro de mama (e.g. péptido 231), permitindo a internalização nas células humanas. A ligação de fármacos anticancerígenos à maior proteína da cápside do fago resultaria numa diminuição da concentração de fármaco in situ necessária à eliminação das células de cancro. Com essa finalidade, a doxorrubicina (DOX) e o PD98059 foram usados devido ao seu efeito sinergístico na morte e proliferação celular. Várias abordagens implementadas evidenciam que a conjugação química da DOX ao fago foi conseguida. Por exemplo, a espectroscopia FT-NIR permitiu a diferenciação entre DOX ou fagos livres e fagos conjugados. A conjugação com o PD98059 não foi realizada devido aos seus problemas de solubilidade. A citotoxicidade in vitro dos fagos (controlo e conjugados com DOX) e da DOX livre foi testada nas linhas celulares tumorais MDA-MB-231 e não tumorais MCF-10-2A. A DOX conjugada induziu citotoxicidade de uma forma não dependente do fago mas, como esperado, o tratamento não foi específico para as células de cancro. A manipulação genética do fago M13KE com os péptidos HIVTat, Penetratin e 231 não foi conseguida, limitando a sua internalização nas células humanas. Paralelamente à análise de citotoxicidade foi desenvolvido um algoritmo de segmentação de imagem capaz de fornecer informação acerca da confluência celular, independentemente da morfologia das células. Desta forma, a variabilidade relacionada com o operador na cultura de células é diminuída. Em suma, os resultados evidenciam a clara necessidade de terapias dirigidas para o tratamento do cancro, bem como o potencial dos fagos como plataformas para terapia.