Copper impacts in grapevine (Vitis vinifera L.): molecular, biochemical and biotechnological approaches

Abstract

Since the development of Bordeaux mixture in the late 1800’s, copper-based fungicides have been widely used against grapevine (Vitis vinifera L.) diseases, mainly in organic but also in conventional viticulture. Although they initially seemed to improve plant growth in unproductive lands, their intensive use has raised concerns regarding toxicity to plants and soil contamination, and research has emerged to characterize copper effects on grapevine physiology. However, at grape berry level the effects of plant exposure to copper remain largely unexplored. In the present study molecular, biochemical and biotechnological approaches were combined to investigate the mechanisms mediating copper transport and compartmentation in grape cells and the consequences of altered copper status in grape berry composition and wine quality. Toxicological assessments in grape cell suspensions (CSB, Cabernet Sauvignon Berry) showed that copper reduced the growth and cell viability in a dose-dependent manner above 100 μM and was accumulated in specific metal ion sinks. Copper transport across the plasma membrane of grape cells was characterized with the copper-sensitive probe Phen Green SK, and results showed that copper uptake was mediated by a high capacity saturable transport system (Km = 583 μM; Vmax = 177 x10-6 %ΔF min-1 protoplast-1), that was regulated by copper availability in the culture medium. The compartmentation of copper in the vacuole of grape cells was studied by fluorescence microscopy and spectrofluorimetry. The pH-sensitive fluorescent probe ACMA showed the involvement of H+-dependent copper transport across the tonoplast, which was dependent on the transmembrane pH gradient generated by both V-H+-ATPase and V-H+-PPase, but apparently not regulated by copper availability in the culture medium. Eight putative COPT/Ctr-type Vitis vinifera copper transporters were identified in the grapevine genome, and expression studies in CSB suspensions showed that VvCTr1 and VvCTr8 were distinctly affected by CuSO4 availability. The in silico analysis of all VvCTr members showed a close phylogenetic relationship to COPT proteins from Arabidopsis and rice, and typical features of Ctr transporters, including the presence of three transmembrane domains. In a field trial, the expression of each VvCTr was studied by qPCR in grape berries and leaves cv. “Vinhão” throughout the fructification season. In plants treated with a triazol-based fungicide, transcripts of VvCTr1 and VvCTr8 were the most abundant in leaves and berries, respectively, while VvCTr4, VvCTr5 and VvCTr7 were the least expressed. The application of Bordeaux mixture induced a transcriptional reprogramming of VvCTr gene expression depending on the developmental stage, which was associated to increased copper levels in grape berries (33.3 μg g-1 DW in the mature phase – washed berries). Further characterization of Ctr-mediated transport was achieved with the functional characterization of VvCTr1. Fusions with fluorescent proteins demonstrated that VvCTr1 monomers are self-interacting and the protein is located to the vacuolar membrane. The expression of VvCTr1 in yeast ctrΔ strains and Arabidopsis copt5 seedlings allowed the validation of its involvement in intracellular copper transport. The presence of VvCTr1 transcripts in grapevine roots, stem and leaves further supported its essential role in copper homeostasis. The effect of Bordeaux mixture on the metabolomics profile of grape berries and leaves cv. “Vinhão” was studied throughout fruit development by GC-TOF-MS, UV-visible spectrophotometry. While copper-treated berries accumulated 7 to 14-fold more copper than control fruits, the levels of sugars, essentially fructose, organic acids and flavan-3-ols were modified at specific developmental stages. A 40% decrease of free natural amino acids including arginine and proline was observed in mature fruits, together with a decrease in mineral nitrogen and protein content. This shift in grape berry composition is likely to have implications in fruit and wine quality. The effect of Bordeaux mixture on the volatile composition of wines cv. “Vinhão” was evaluated by Liquid-Liquid Microextraction GC-FID and SPE GC-Ion Trap-MS analyses. Laboratory-scale vinifications were performed, and a significant delay in the degradation of reducing sugars was observed in musts from copper-treated grapes, which contained 12.6 mg L-1 copper at the end of fermentation. Increased copper levels promoted a decrease in the levels of higher alcohols, including isoamyl alcohol, aldehydes, including acetaldehyde, esters of organic acids, lactones, volatile phenols and ketones, while increasing the levels of acetates, volatile fatty acids, fatty acid ethyl esters and terpenes, namely linalool. Besides its importance at a scientific standpoint, the present study contributed to elucidate the effect of copper-based fungicides in grape berry composition and wine quality.

Desde o desenvolvimento da calda bordalesa no final do século XIX, os fungicidas à base de cobre têm sido amplamente usados para combater doenças da videira (Vitis vinifera L.), especialmente na agricultura biológica. Diversos estudos têm sido direcionados para avaliar o impacto da aplicação de cobre na fisiologia da videira, embora permaneça pouco estudado o seu efeito ao nível do fruto. No presente trabalho foram combinadas abordagens moleculares, bioquímicas e de carácter biotecnológico para investigar os mecanismos envolvidos no transporte e compartimentação do cobre nas células do bago de uva, bem como os efeitos da alteração dos níveis de cobre na composição do bago e na qualidade do vinho. A sonda fluorescente Phen Green SK foi utilizada para estudar o transporte de cobre através da membrana plasmática de células CSB (Cabernet Sauvignon Berry). Os resultados mostraram que a entrada de cobre é mediada por um sistema de transporte saturável de elevada capacidade, regulado pela disponibilidade de cobre no meio de cultura. Os resultados obtidos com a sonda fluorescente ACMA, sensível ao pH, mostraram que o movimento do cobre através da membrana vacuolar é mediado por um sistema de antiporte com H+, dependente do gradiente de H+ gerado pelas bombas V-H+-ATPase e V-H+-PPase. A análise do genoma da videira permitiu identificar oito genes codificantes de transportadores de cobre do tipo COPT/Ctr (VvCTr1-VvCTr8). Estudos in silico mostraram um elevado grau de semelhança entre as sequências aminoacídicas dos VvCTr e dos COPT de Arabidopsis e de Oryza sativa, bem como a presença de motivos típicos dos Ctrs. O trabalho subsequente incluiu ensaios de campo que possibilitaram o estudo do efeito da aplicação da calda bordalesa na expressão dos VvCTrs em bagos e em folhas de videira da variedade Vinhão. Os resultados de qPCR mostraram que em plantas tratadas unicamente com fungicidas à base de triazol, os genes VvCTr1 e VvCTr8 foram os mais expressos em folhas e bagos, respectivamente, enquanto os genes VvCTr4, VvCTr5 e VvCTr7 foram os menos expressos. Em plantas tratadas com calda bordalesa ocorreu uma reprogramação da expressão dos VvCTrs, cujo padrão foi dependente do estado de desenvolvimento do fruto. O tratamento com a calda bordalesa provocou aumentos de 7 a 14 vezes dos níveis de cobre em bagos lavados. Os estudos prosseguiram com o intuito de se caracterizar funcionalmente os transportadores de cobre da videira. Neste âmbito, o gene VvCTr1 foi clonado a partir de cDNA de bago e a sua função como transportador intracelular de cobre foi demonstrada por complementação de mutantes de levedura (ctr1Δctr3Δctr2Δ e ctr1Δctr3Δ) e de Arabidopsis (copt5). Adicionalmente, estudos de localização subcelular com proteínas de fusão fluorescentes mostraram que os monómeros de VvCTr1 são capazes de interagir entre si e que o transportador se localiza na membrana vacuolar. O efeito da calda bordalesa no metaboloma do bago e de folhas de videira da variedade Vinhão sujeitas ao protoloco de tratamento descrito anteriormente foi também alvo de estudo. A análise dos extratos por “GC-TOF-MS” mostrou que os bagos de plantas tratadas com cobre sofreram alterações metabólicas, traduzidas por níveis diferentes de açúcares, de aminoácidos, de ácidos orgânicos e de alguns metabolitos secundários em fases específicas do desenvolvimento. Em particular, em bagos maduros de plantas sujeitas ao tratamento com cobre o conteúdo em aminoácidos livres sofreu uma redução de 40%, acompanhada por uma redução menos significativa dos níveis de proteína total e de azoto mineral. No presente trabalho foi ainda estudado o efeito dos níveis de cobre no mosto - resultantes da aplicação de calda bordalesa -, na constituição volátil do vinho. Para o efeito, foram efectuadas vinificações à escala laboratorial, tendo-se observado um atraso significativo na conversão de açúcares redutores em mostos de bagos tratados com cobre. Os níveis elevados de cobre (12.6 mg L-1) promoveram uma diminuição do conteúdo em álcoois, aldeídos, estéres de ácidos orgânicos, lactonas, fenóis voláteis e cetonas. Em paralelo, foi observado um aumento dos níveis de acetatos, ácidos gordos voláteis, ésteres etílicos de ácidos gordos e terpenos. O presente estudo revestiu-se de uma dimensão fundamental e aplicada e contribuiu para se compreenderem melhor os efeitos dos fungicidas à base de cobre na constituição química do bago de uva e no perfil aromático do vinho.