Understanding the role of KRAS-regulated autophagy in colorectal cancer: therapeutic implications

Abstract

KRAS mutations (KRASMUT) are one of the most frequent genetic alterations present in colorectal cancer (CRC). Recently, KRAS has been described to be involved in autophagy, which is a cellular process whose role in cancer development still remains controversial, being designated as a double-edged sword. Recent data showed that CRC cells display high basal autophagic levels (a phenomenon denominated “autophagy addition”), which seem to be a metabolic advantage. In fact, our group has demonstrated that autophagy is important for CRC cells survival and that this catabolic process is regulated by KRASMUT in the colon model. Besides being an autophagy modulator, KRASMUT is also a molecular biomarker of resistance anti-EGFR inhibitors therapy. This project general aim was to better understand how KRAS regulates autophagy in the colon model and how this impacts CRC therapeutic approaches. Specifically, we determined if upon autophagy induction by starvation the levels of KRAS changed and whether KRAS altered its localization in response to this stimulus. Furthermore, we explored the potential clinical impact of KRAS or autophagy inhibition in CRC. For these purposes, we used different cell lines: two CRC cell lines harbouring different KRASMUT and a non-cancer colon model stably expressing KRASWT and three hotspot mutations (KRASG12D, KRASG13D and KRASG12V). Additionally, in order to achieve our goals several molecular biology techniques were performed, including western blot analysis, SRB and immunofluorescence assays and RNA interference technique. Our data reinforced our understanding of the crucial role of KRAS and autophagy in CRC carcinogenesis and suggested the use of KRAS and autophagy as effective targets for the development of more efficient CRC therapeutic strategies.

Mutações que afetam o KRAS (KRASMUT) são uma das mais frequentes alterações genéticas presentes no cancro colorretal (CCR). Recentemente, o KRAS foi descrito como estando envolvido na autofagia, um processo celular cujo papel no desenvolvimento no cancro permanece ainda controverso, sendo considerado uma “faca de dois gumes”. Contudo, dados bastante recentes mostram que linhas celulares derivadas de CCR exibem elevados níveis basais de autofagia (um fenómeno denominado "adição autofágica"), o que parece constituir vantagem metabólica. Na verdade, o nosso grupo demonstrou que a autofagia é importante para a sobrevivência celular e que este processo catabólico é regulado pelo KRASMUT no modelo do cólon. Além de ser um modulador de autofagia, o KRASMUT é também um biomarcador molecular de resistência à terapia de inibidores anti-EGFR. O objetivo geral do projeto foi compreender melhor como o KRAS regula a autofagia no modelo de cólon e qual poderá ser o impacto dessa regulação nas abordagens terapêuticas do CCR. Especificamente, determinámos se após a indução de autofagia por restrição de nutrientes os níveis de KRAS se alteravam e se esta proteína modificava a sua localização em resposta a este estímulo. Além disso, explorámos o potencial impacto clínico da inibição do KRAS ou da autofagia na terapia CCR. Para tal, utilizámos três modelos diferentes: duas linhas celulares de CCR com duas KRASMUT diferentes e um modelo de cólon não cancerígeno que expressa estavelmente KRASWT e três mutações “hotspot” (KRASG12D, KRASG13D e KRASG12V) deste oncogene. Adicionalmente, de modo a atingirmos os nossos objectivos, várias técnicas de biologia molecular foram desenvolvidas, incluindo análise de níveis de expressão proteica por western blot, ensaios de SRB e imunofluorescência e a técnica de RNAi, entre outras. Os nossos resultados reforçam o papel crucial do KRAS e da autofagia na carcinogénese do CCR e, consequentemente identifica-os como alvos importantes e eficazes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficientes.