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https://hdl.handle.net/1822/34729
Título: | Silk fibroin-based scaffolds, hydrogels and calcium-phosphate filled materials aimed for regenerative medicine applications |
Outro(s) título(s): | Matrizes tridimensionais porosas, hidrogéis e materiais reforçados com fosfatos de cálcio à base de fibroína de seda para aplicação em medicina regenerativa |
Autor(es): | Yan, Leping |
Orientador(es): | Reis, R. L. Oliveira, A. L. |
Data: | 16-Jun-2014 |
Resumo(s): | Bone and cartilage defects derived from trauma or disease are major problems in
orthopedics. Tissue engineering and regenerative medicine provides promising strategies for
the regeneration of damaged tissues. Biomaterials, processed into porous scaffolds and
hydrogels, have been playing a crucial role in the tissue regeneration. Controlling the
physicochemical properties of biomaterials is important for inducing proper cellular response
towards tissue formation, thus facilitating the regeneration procedure. While the ideal tissue
regeneration outcome has not yet been achieved, great progress had been made in the last
decades, in terms of the application of biomaterials for tissue regeneration.
The aim of this thesis is to develop novel silk fibroin (SF) based porous scaffolds and
hydrogels with adequate properties and controlled conformations for different tissues
regeneration. Several strategies were used in this thesis, including the improvement of
scaffolds’ strength, biomimetic of the tissue composition and stratified structure, and
development of stimuli-responsive hydrogels with injectable or spatial tunable properties. SF
derived from Bombyx mori cocoons was chosen as the matrix material because it has many
advantages. It is a biodegradable protein based biomaterial with superior in vitro and in vivo
biocompatibility. Moreover, its mechanical properties and degradation profile can be tuned by
the processing approach. SF can be processed into different shapes and architectures, and it
is a readily available supply.
Salt-leached SF scaffolds with superior mechanical properties were produced by using highly
concentrated aqueous SF solutions. The compressive and storage moduli of the scaffolds
were significantly enhanced with increasing the concentration of SF solution. The developed
scaffolds were of macro/microporous structure, high porosity and interconnectivity, and
presented a homogeneous porosity distribution. The obtained scaffolds present adequate
properties for cartilage and meniscus regeneration.
Mimicking the composition of natural bone, composite scaffolds composed of SF and calcium
phosphate were developed for bone regeneration. Nano calcium phosphate particles were
incorporated in the concentrated SF solution using an in-situ synthesis method following saltleaching
to develop the silk-nano calcium phosphate (Silk-NanoCaP). These scaffolds
maintained the superior mechanical properties of SF scaffolds but demonstrated in vitro
bioactivity. The NanoCaP particles were homogeneously distributed in the silk matrix, at both
macroscopic and microscopic levels. The leachables of the scaffolds were non-cytotoxic as
determined by in vitro cytotoxicity assays.
The in vitro and in vivo biological performance of both SF and Silk-NanoCaP scaffolds was
further evaluated. These scaffolds supported the viability and proliferation of human adipose
tissue derived stromal cells. The formed extracellular matrix improved the mechanical
properties of the cell-laden scaffolds or constructs. In vivo, both scaffolds have supported de
novo bone formation and ingrowth’s and induced no acute inflammatory response. The Silk NanoCaP scaffold was osteoconductive as new bone grew directly on its surface. This group
induced higher amount of new bone formation than the SF group. The Silk-NanoCaP
scaffolds can be used in bone regeneration.
Considering the stratified/composition characteristics of osteochondral tissue, bilayered
scaffolds composed of a SF layer and a Silk-NanoCaP layer were produced for
osteochondral defects (OCD) regeneration. The in vitro bioactivity was only observed in the
Silk-NanoCaP layer i.e., the bone-like layer. When seeded with marrow mesenchymal
stromal cells, the bilayered scaffolds promoted cell viability and proliferation, and the Silk-
NanoCaP layer induced a higher alkaline phosphatase level as compared to the SF layer
(cartilage-like layer). In vivo subcutaneous implantation showed that the scaffolds supported
tissue infiltration and no granulation tissue or acute inflammation were observed. When
implanted in the rabbit OCD, the bilayered scaffolds supported cartilage regeneration in the
SF layer and promoted bone ingrowths in the Silk-NanoCaP layer. Therefore, they
demonstrated to be promising candidates for OCD regeneration.
Besides the development of SF based scaffolds, another approach explored in this thesis
was to develop injectable and enzymatically cross-linked SF hydrogels that could be suitable
for cartilage regeneration. The SF hydrogels were prepared by peroxidase mediated crosslinking
of the tyrosine groups in the backbone of SF. These hydrogels could be formed in a
few minutes under physiological conditions. Dominant amorphous conformation was
presented in these hydrogels. These hydrogels were ionic strength and pH stimuli
responsive. Cells were successfully encapsulated into these hydrogels. Subcutaneous
implantation showed that these hydrogels did not induce any acute inflammatory reaction.
After in vitro cell culture or in vivo implantation, β-sheet conformation was observed in these
hydrogels. The developed SF hydrogels can be used as an injectable material for filling
tissue defects (such as bone or cartilage) or as a drug delivery system.
Finally, SF hydrogels with spatially controllable properties were generated. Core-shell SF
hydrogels consisted in a β-sheet conformation in the shell layer and mainly an amorphous
conformation in the core layer. These were prepared by the controlled immersion of the
peroxidase mediated SF hydrogels in methanol. The thickness of the shell layer and the
mechanical properties of the core-shell SF hydrogels increased with increasing the
immersion time. When incorporating albumin as a model drug, the core-shell SF hydrogels
presented slower and more controllable release profile as compared to the SF hydrogel. The
core-shell SF hydrogels can be used as a controlled release system, tissue substitute or
both.
In this thesis, different strategies for developing novel SF based scaffolds and enzymatically
cross-linked hydrogels were explored. In both cases remarkable properties and functions for
tissue engineering and regenerative medicine applications were achieved, as well as a high
reproducibility of the systems. The SF based scaffolds and enzymatically cross-linked SF
hydrogels provided herein can be promising candidates for cartilage, meniscus, bone, and
osteochondral regeneration, as well as drug delivery systems or tissue substitutes. Os defeitos ósseos e de cartilagem resultantes de trauma ou de um processo degenerativo são os principais problemas em ortopedia. As áreas da engenharia de tecidos e a medicina regenerativa têm permitido propor um conjunto de estratégias promissoras para a regeneração dos tecidos danificados. Neste âmbito, os biomateriais quando processados sob a forma de matrizes tridimensionais porosas e hidrogéis têm desempenhado um papel crucial na regeneração dos tecidos. Mas o controlo das propriedades dos biomateriais é também importante, uma vez que influenciam a resposta celular e a formação do novo tecido. Assim sendo, a melhoria das propriedades físico-químicas dos biomateriais como estratégia para a optimização do processo de regeneração de tecidos, científicas de maior relevo por forma a facilitar o processo de regeneração constitui uma questão científica relevante. Esta tese tem como objetivo o desenvolvimento de novas matrizes tridimensionais prorosas e hidrogéis à base de fibroína de seda (FS) com propriedades adequadas e conformações controladas para regeneração de diferentes tecidos. Neste contexto, foram utilizadas várias estratégias, incluindo a melhoria das propriedades mecânicas, utilização de composições biomiméticas e abordagens de estratificação no processo de produção das matrizes tridimensionais porosas, e desenvolvidos hidrogéis injetáveis e sensíveis a estímulos com propriedades ajustáveis. A FS derivada de casulos da espécie de Bombyx mori foi escolhida como o material base, dado que possui inúmeras vantagens. É um biomaterial de natureza protéica e biodegradável, e cuja biocompatibilidade tem sido demonstrada in-vitro e in-vivo. Além disso, as propriedades mecânicas e o perfil de degradação podem ser optimizados durante as várias etapas de processamento. A FS pode ser ainda processada em diferentes formas e arquiteturas, sendo uma fonte prontamente disponível. Inicialmente, foram produzidas matrizes tridimensionais porosas através do processo de “saltleaching”. Estas matrizes apresentam propriedades mecânicas superiores, uma vez que foram usadas soluções aquosas de FS altamente concentradas. Os módulos de elasticidade e de compressão das estruturas obtidas foram significativamente melhorados com o aumento da concentração da solução de FS. As matrizes desenvolvidas apresentam uma estrutura com macro- e micro-porosidade, interconectividade, e distribuição homogénea dos poros. As matrizes obtidas apresentam propriedades adequadas para a regeneração de cartilagem e menisco. Por forma a mimetizar a composição natural do osso e promover a regeneração óssea, foram desenvolvidas estruturas compósitas de FS e fosfato de cálcio. Assim, foi desenvolvido uma matriz tridimensional porosa e compósita de seda-nanofosfato de cálcio (Seda-NanoCaP), através da síntese in-situ de nanopartículas de fosfato de cálcio na solução de FS concentrada, seguido do método de “salt-leaching”. Estas matrizes possuem propriedades mecânicas superiores, e apresentam bioatividade in-vitro. As partículas de NanoCaP foram homogeneamente distribuídas na matriz de seda, ao nível macroscópico e microscópico. Verificou-se que os materiais lixiviados destas estruturas não são citotóxicos, tal como demonstrado em ensaios de avaliação da citotoxicidade invitro. O desempenho biológico de ambas as matrizes de FS e seda- NanoCaP foi ainda avaliado in-vitro e in-vivo. Estas matrizes tridimensionais porosas suportaram a viabilidade e proliferação de células obtidas do estroma de tecido adiposo humano. A matriz extracelular produzida, permitiu melhorar as propriedades mecânicas dos dois tipos de matrizes tridimensionais porosas de SF. In-vivo, ambas as matrizes permitiram a formação de novo osso sem indução de resposta inflamatória aguda. No entanto, a matriz de seda-NanoCaP tem capacidade osteocondutora superior, uma vez que suportou o crescimento de novo osso directamente na sua superfície. Estas estruturas tridimensionais porosas e compósitas induziram uma maior quantidade de formação de novo osso em comparação com a matriz de FS. Desta forma as matrizes de seda-NanoCaP são as mais adequadas para serem utilizadas na regeneração óssea. Considerando as características do tecido osteocondral e a sua composição estratificada foram desenvolvidas matrizes tridimensionais porosas em bicamada, constituídas por uma camada de SF e uma camada compósita de Seda-NanoCaP para a regeneração de defeitos osteocondrais (DOC). A bioatividade in-vitro foi observada apenas na camada Seda-NanoCaP, a camada semelhante ao osso. Quando cultivada com células mesenquimais isoladas da medula óssea, as matrizes de bicamada promoveram a viabilidade e proliferação celular. A camada de seda-NanoCaP induziu uma expressão mais elevada da fosfatase alcalina em comparação com a camada de FS. In-vivo, as matrizes tridimensionais porosas de bicamada permitiram a infiltração de tecido e não foi observado tecido de granulação ou inflamação aguda, após a implantação subcutânea. Quando implantado num DOC crítico em modelo de coelho, as matrizes de bicamada permitiram a regeneração da cartilagem na camada de FS e o crescimento ósseo na camada de Seda-NanoCaP. Desta forma, estas matrizes mostraram ser muito promissoras na regeneração osteocondral. Além do desenvolvimento de matrizes tridimensionais porosas à base de FS para a regeneração da cartilagem, foram também produzidos com sucesso hidrogéis injectáveis, reticulados por via enzimática. Os hidrogéis de FS foram preparados a partir da reticulação dos grupos de tirosina na cadeia principal da FS, recorrendo à actividade da enzima peroxidase. Estes hidrogéis formam-se em poucos minutos e em condições semelhantes às condições fisiológicas. Apresentam uma conformação amorfa dominante, e são sensíveis a estímulos de força iónica e pH. Permitem também o encapsulamento de células. Através de um implante subcutâneo foi possível demonstrar que os hidrogéis não induzem reação inflamatória aguda, em modelo de ratinho. Após cultura de células invitro ou implantação in-vivo, foi observada a alteração de conformação para folha β nestes hidrogéis. Os hidrogéis desenvolvidos podem ser utilizados como um material injectável para o preenchimento de defeitos em tecidos, tais como osso e cartilagem ou como um sistema de libertação controlada de fármacos. Finalmente, foram desenvolvidos hidrogéis de FS com propriedades controláveis ao nível espacial. Estes hidrogéis de FS apresentam uma camada externa em conformação de folha β e um núcleo amorfo, e foram preparados por imersão controlada do gel em metanol, após reticulação enzimática. A espessura da camada de invólucro e as propriedades mecânicas dos hidrogéis de FS aumentam ao longo do tempo de imersão em metanol. Em estudos de prova de conceito usando a albumina como um fármaco-modelo, os hidrogéis revestidos apresentam um perfil de libertação mais lento e controlável, em comparação com o hidrogel de SF não tratado com metanol. Os hidrogéis com diferentes conformações podem ser usados como sistemas de libertação controlada, substitutos de tecidos ou ambos. Nesta tese, foram exploradas diferentes estratégias para o desenvolvimento de matrizes tridimensionais porosas e hidrogéis reticulados por via enzimática. Em ambos os casos foram obtidas propriedades e funções notáveis para aplicações em diferentes abordagens da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, bem como uma elevada reprodutibilidade dos sistemas. As matrizes tridimensionais porosas de FS e os hidrogéis reticulados enzimaticamente aqui propostos constituem candidatos promissores para a regeneração de cartilagem, menisco, osso e tecido osteocondral, podendo actuar simultaneamente como um sistema para a libertação controlada de fármacos. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e Células Estaminais |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/34729 |
Acesso: | Acesso aberto |
Aparece nas coleções: | DEP - Teses de Doutoramento |
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