Utilize este identificador para referenciar este registo: https://hdl.handle.net/1822/34947

TítuloDesign and construction of a new biosynthetic pathway for the production of curcuminoids in Escherichia coli
Autor(es)Rodrigues, Joana Lúcia Lima Correia
Orientador(es)Rodrigues, L. R.
Kluskens, Leon
Prather, Kristala L. J.
Data18-Dez-2014
Resumo(s)Curcuminoids are plant phenolic compounds with great anti-cancer potential. This thesis addresses the construction of an artificial biosynthetic pathway for curcuminoids production in Escherichia coli. This production was triggered by chemical or thermal induction to be used in industrial applications or bacterial therapies, respectively. To produce curcuminoids, including curcumin, from tyrosine, caffeic acid was produced as an intermediate in the pathway. The caffeic acid pathway design included tyrosine ammonia lyase (TAL) from Rhodotorula glutinis to convert tyrosine to p-coumaric acid and 4-coumarate 3-hydroxylase (C3H) from Saccharothrix espanaensis or cytochrome P450 CYP199A2 from Rhodopseudomonas palustris to convert p-coumaric acid to caffeic acid. TAL was able to efficiently convert tyrosine to p-coumaric acid and CYP199A2 exhibited higher catalytic activity towards p-coumaric acid than C3H. This is the first study that shows caffeic acid production using CYP199A2 and tyrosine as the initial precursor; 280 mg/L of caffeic acid was produced. After validating the first steps of the pathway, curcuminoids production was studied. The best results were obtained with Arabidopsis thaliana 4-coumaroyl-CoA ligase (4CL1) and Curcuma longa diketide-CoA synthase (DCS) and curcumin synthase (CURS1), yielding 70 mg/L of curcumin from ferulic acid. To produce curcumin through the caffeic acid pathway, caffeoyl-CoA O-methyltransferase from Medicago sativa was used to convert caffeoyl-CoA to feruloyl-CoA. Using caffeic acid, p-coumaric acid or tyrosine as a substrate, 3.90 mg/L, 0.26 mg/L and 0.20 mg/L of curcumin were produced, respectively. Finally, caffeic acid and curcumin production was induced by heat using the dnaK heat shock promoter. Caffeic acid was successfully produced from tyrosine using TAL, C3H or CYP199A2 and the highest production was 14.41 mg/L. Regarding curcumin, 0.37 mg/L was produced from ferulic acid using 4CL1, DCS and CURS1. This is the first report on the in vivo use of DCS and CURS1 to produce curcuminoids. It was also demonstrated that curcumin can be produced from tyrosine using a pathway through the caffeic acid production. This alternative pathway represents a significant improvement in the heterologous production of curcuminoids using E. coli. In addition, caffeic acid and curcumin production in E. coli can be triggered by heat, thus suggesting its potential for the development of new bacterial therapies.
Os curcuminóides são compostos fenólicos de plantas com grande potencial anti-cancerígeno. Esta tese aborda a construção de uma via biossintética para a produção artificial de curcuminóides em Escherichia coli. Esta produção foi induzida por via química ou térmica para ser usada em aplicações industriais ou em terapias bacterianas. Para produzir os curcuminóides, incluindo a curcumina, a partir da tirosina, o ácido cafeico foi produzido como intermediário na via. A via do ácido cafeico incluiu a tirosina amónia liase (TAL) da Rhodotorula glutinis para converter a tirosina em ácido p-cumárico e o 4-cumarato 3-hidroxilase (C3H) da Saccharothrix espanaensis ou o citocromo P450 CYP199A2 da Rhodopseudomonas palustris para converter o ácido p-cumárico em cafeico. TAL foi capaz de converter de forma eficiente a tirosina em ácido p-cumárico e CYP199A2 exibiu uma maior actividade catalítica em relação ao ácido p-cumárico do que C3H. Este é o primeiro estudo que mostra a produção de ácido cafeico utilizando CYP199A2 e a tirosina como precursor; tendo sido produzidos 280 mg/L. Depois de validar os primeiros passos da via, os curcuminóides foram produzidos. Os melhores resultados foram obtidos com a 4-cumaroil-CoA ligase (4CL1) da Arabidopsis thaliana e com a dicetídeo-CoA sintase (DCS) e curcumina sintase 1 (CURS1) da Curcuma longa e 70 mg/L de curcumina foram produzidos a partir do ácido ferúlico. Para produzir curcumina pela via do ácido cafeico, a cafeoil-CoA O-metiltransferase da Medicago sativa foi utilizada para converter o cafeoil-CoA em feruloil-CoA. Utilizando o ácido cafeico, o ácido p-cumárico e a tirosina como substrato, 3.90 mg/L, 0.26 mg/L e 0.20 mg/L de curcumina foram produzidos, respectivamente. Finalmente, a produção de ácido cafeico e de curcumina foi induzida por calor utilizando o promotor de choque térmico dnaK. O ácido cafeico foi produzido com sucesso usando TAL, C3H ou CYP199A2 e a sua maior produção foi de 14,41 mg/L. Em relação à curcumina, foram produzidos 0,37 mg/L usando 4CL1, DCS e CURS1. Este é o primeiro estudo sobre a utilização in vivo de DCS e CURS1 para produzir curcuminóides. A curcumina foi também produzida pela primeira vez a partir da tirosina usando a via de produção de ácido cafeico. A produção de ácido cafeico e de curcumina pode também ser despoletada por calor, sugerindo assim o seu potencial para o desenvolvimento de novas terapias bacterianas.
TipoTese de doutoramento
DescriçãoTese de doutoramento em Bioengenharia
URIhttps://hdl.handle.net/1822/34947
AcessoAcesso aberto
Aparece nas coleções:BUM - Teses de Doutoramento
CEB - Teses de Doutoramento / PhD Theses

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