Combined laccase-ultrasound processes for industrial applications

Abstract

Bioprocesses including sonochemical systems have been of great importance for various industrial sectors. The improvement of the biological, chemical and physical performances leading to sustainable processes with reduced environmental impact are the main features responsible for the high interest on these technologies at industrial level. In this work, a combined laccase-ultrasound system was introduced in two distinct areas: cotton bleaching and urinary catheters functionalization. Regarding the cotton bleaching, the work was developed in three different phases: 1st phase: characterization of acoustic and hydrodynamic reactors with different geometries, namely two ultrasonic power generators (ultrasonic power generator type K8 with 850 kHz and ultrasonic bath equipment Ultrasonic cleaner USC600TH with 45 kHz) and two homogenizers (EmulsiFlex®-C3 and APV-2000); the optimal operating conditions for cotton bleaching were selected according to the highest hydroxyl radical production and the lowest required energy input; comparing the profile of each reactor, the medium frequency (850 kHz) ultrasonic power generator type K8 was the equipment that promoted highest hydroxyl radical production requiring low energy input, proving to be the best choice for further experiments; 2nd phase: combined laccase–hydrogen peroxide process assisted by ultrasound as an alternative approach to conventional cotton bleaching; two sequential stages were established: (1) laccase pretreatment and (2) hydrogen peroxide bleaching, both assisted by ultrasound; sonication mode (continuous or discontinuous pulse), hydrogen peroxide concentration, reaction temperature and processing time were the experimental parameters optimized; compared with the conventional methods, the combined laccase-hydrogen peroxide bleaching assisted by ultrasound (continuous pulse mode) allowed increase whiteness levels and reduce the amount of hydrogen peroxide in 50%; the energy consumption in terms of temperature (reduction of 40 ºC) and operating time (reduction of 90 minutes) was also reduced; 3rd phase: scale up of the combined laccase-hydrogen peroxide/ultrasound system aiming to develop a novel ultrasonic pilot scale reactor for cotton bleaching; an existing dyeing machine was transformed and adapted by including piezoelectric ultrasonic devices; standard half (4 g/L H2O2 at 90 ºC for 60 minutes) and optical (8 g/L H2O2 at 103 ºC for 40 minutes) cotton bleaching processes were used as references; laboratory experiments demonstrated that both low frequency, high power (22 kHz, 2100 W) and high frequency, low power ultrasounds (850 kHz, 400 W) were required to achieve satisfactory results; the laccase pretreatment assisted by high frequency ultrasound followed by the bleaching treatment using high power ultrasound promoted the highest whitening values; the developed ultrasonic pilot scale reactor allowed improving the cotton whitening efficiency using the combined laccase-hydrogen peroxide bleaching assisted by ultrasound and subsequently, less energy (temperature) and chemicals (hydrogen peroxide) were needed resulting in operational costs reduction. Overall, this technology allowed the laccase and hydrogen peroxide treatment combination in a continuous process. The developed pilot-scale reactor offers an enhancement of the cotton bleaching process with lower environmental impact as well as conducts to a better performance of further finishing operations. Concerning the urinary catheter functionalization, it was studied the polyurethane (PU) and silicone (SI) catheters coating with poly(catechin) to reduce the bacterial adhesion onto the devices surface. Laccase was used as a biocatalyst to oxidize the catechin monomer and produce the corresponding polymer. The catheter surface functionalization was optimized following two different approaches: with and without previous alkali pretreatment. The results indicated higher polymer attachment levels for the alkali-treated catheters (+18% for PU and +33% for SI catheters). The reduction of biofilm formation onto the catheter surface was quantitatively evaluated under static adhesion conditions against Escherichia coli (96% reduction on PU) and Staphylococcus epidermidis (81% reduction on SI). Though the catheter material type greatly influenced the bacterial adhesion, the alkali treatment was consistently beneficial for the poly(catechin) attachment and consequent biofilm reduction. Thus, the produced polymer was efficiently attached onto the catheters surface hindering the bacterial adhesion and the antibiofilm activity was dependent on the material-microorganism set. Functionalized PU catheter had strong effect on E. coli adhesion while functionalized SI catheter had activity against S. epidermidis. The oxidized flavonoid revealed to be a promising approach to prevent bacterial adhesion thus prolonging the life-span of catheters inside the human body. Nevertheless, aiming improving the antibiofilm activity of poly(catechin) coated catheters, it was explored the enzymatic synthesis of poly(catechin)-antibiotic conjugates as an alternative antimicrobial coating. Catechin was conjugated with two antibiotics, namely trimethoprim (TMP) and sulfamethoxazole (SMZ) via activation with N,N’-disuccinimidyl carbonate(DSC) and subsequent coupling to molecules containing α-amine terminals. SI and PU catheters were in-situ functionalized through laccase oxidation of catechin-antibiotic conjugates. Four antimicrobial coatings were produced, namely with poly(catechin), poly(catechin)-TMP, poly(catechin)-SMZ and poly(catechin)-TMP-SMZ. The bacterial adhesion reduction was tested on the functionalized devices using gram-negative and gram-positive strains. The most significant reduction in adhesion was observed with poly(catechin)-TMP (gram-negative: - 85% and gram-positive: - 87%) and with poly(catechin)-TMP-SMZ (gram-negative: - 85% and gram-positive: - 91%). The cytotoxicity to mammalian cells was assessed by indirect contact for 5 days and revealed that all the tested coatings supported more than 90% of viable cells. Concluding, in this work, a novel promising approach for increasing the indwelling catheters life-span was developed aiming to reduce catheter-associated chronic infections. Combined laccase-ultrasound processes revealed a great potential for industrial fields with distinct application topics allowing the overall costs processing reduction, a minor environmental impact and the production of novel products with improved or new properties contributing therefore to the enhancement of human life quality.

Os bioprocessos e os sistemas sonoquímicos têm sido de grande importância para vários setores industriais. A melhoria do desempenho de reações biológicas, químicas e físicas, que conduziu a processos sustentáveis com reduzido impacto ambiental é a principal responsável pelo elevado interesse nestas metodologias por parte da indústria. Neste trabalho, a combinação da lacase com o uso de ultrassons foi introduzida em duas áreas distintas: o branqueio do algodão e na funcionalização de cateteres urinários. No que respeita ao branqueio de algodão, o trabalho foi desenvolvido em três fases distintas: 1ª fase: consistiu na caraterização de reatores acústicos e hidrodinâmicos com diferentes geometrias, nomeadamente dois geradores de energia ultrassónica (ultrasonic power generator type K8 com 850 kHz e ultrasonic bath equipment Ultrasonic cleaner USC600TH com 45 kHz) e dois homogeneizadores (EmulsiFlex®-C3 e APV-2000); as condições ótimas de operação para o branqueio de algodão foram selecionadas de acordo com a maior produção de radicais hidroxilo e a menor intensidade de energia envolvida; comparando o comportamento de cada reator, o gerador de média frequência (850 kHz) foi o equipamento que promoveu maior produção de radicais hidroxilo com baixa intensidade de energia, o que provou ser a melhor escolha para os ensaios posteriores; 2ª fase: combinação de lacase com peróxido de hidrogénio na presença de ultrassons como uma abordagem alternativa ao branqueio convencional do algodão; duas fases sequenciais foram estabelecidas para este processo: (1) o pré-tratamento com lacase e (2) o branqueio com peróxido de hidrogénio, ambos assistidos por ultrassons; o modo de sonicação (pulsação contínua ou descontínua), a quantidade de peróxido de hidrogénio, a temperatura de reação e o tempo de processamento foram os parâmetros experimentais otimizados; comparado com os métodos convencionais, o branqueio combinado com lacase e peróxido de hidrogénio assistido por ultrassons (modo de pulsação contínuo) permitiu aumentar os níveis de grau de branco e reduzir em 50% a quantidade de peróxido de hidrogénio; o consumo de energia em termos de temperatura (redução de 40 ºC) e tempo de processamento (redução de 90 minutos) também foi reduzido; 3ª fase: ampliar à escala piloto o sistema combinado de laccase e peróxido de hidrogénio/ultrassons de modo a desenvolver um novo reator ultrassónico para o branqueio de algodão; uma máquina de tingimento industrial foi transformada e adaptada com dispositivos ultrassónicos piezoelétricos e as receitas padrão para o meio branco (4 g/L H2O2 a 90 ºC durante 60 minutos) e para branco ótico (8 g/L H2O2 a 103 ºC durante 40 minutes) foram usadas como referência; os ensaios laboratoriais demonstraram que ambos os ultrassons de baixa frequência/alta energia (22 kHz, 2100 W) e de alta frequência/ baixa energia (850 kHz, 400 W) foram eficazes na obtenção de resultados satisfatórios; o pré-tratamento com lacase assistido com ultrassons de alta frequência (850 kHz) seguido do branqueio a alta energia (2100 W) de ultrassons promoveu os graus de brancura mais elevados; o reator ultrassónico desenvolvido à escala piloto permitiu melhorar a eficiência do branqueio usando o processo combinado de lacase e peróxido de hidrogénio assistido por energia de ultrassons e subsequentemente, menos energia (temperatura) e químicos (peróxido de hidrogénio) foram necessários, resultando na redução dos custos operacionais. Em geral, esta tecnologia permitiu a combinação de lacase e de peróxido de hidrogénio num processo contínuo. O reator desenvolvido à escala piloto oferece uma melhoria no processo de branqueio do algodão, com menor impacto ambiental, bem como um melhor desempenho dos futuros processos de tingimento. Em relação ao desenvolvimento de cateteres urinários antimicrobianos foi estudado o revestimento de cateteres de poliuretano (PU) e de silicone (SI) para reduzir a adesão bacteriana na superfície destes dispositivos. A lacase foi usada como biocatalisador para oxidar a catequina e produzir o polímero correspondente. A funcionalização da superfície do cateter foi otimizada seguindo duas abordagens: com e sem pré-tratamento alcalino. Os resultados indicaram uma maior deposição do polímero em cateteres tratados alcalinamente (+18% para PU e +33% para SI cateteres). A redução da formação de biofilme à superfície do cateter foi quantitativamente avaliada sob condições de adesão estática contra Escherichia coli (redução de 96% no PU) e Staphylococcus epidermidis (redução de 81% no SI). Apesar do tipo de material do cateter ter influenciado a adesão bacteriana, o tratamento alcalino foi consistentemente benéfico para a deposição de poli(catequina) e consequente redução de biofilme. Assim, o polímero produzido foi eficazmente ligado à superfície dos cateteres, dificultando a adesão bacteriana, e a atividade antibiofilme dependeu do conjunto material-organismo. A funcionalização nos cateteres de PU teve um grande efeito na adesão de E. coli enquanto nos cateteres de SI a atividade foi superior contra S. epidermidis. Os flavonóides oxidados revelaram ser uma abordagem promissora para prevenir a adesão bacteriana, prolongando o tempo de vida dos cateteres no corpo humano. Contudo, tendo como objetivo melhorar a atividade antibiofilme do revestimento de poli(catequina), foi explorada a síntese enzimática de conjugados de poli(catequina) e antibióticos como alternativa para revestimentos antimicrobianos. A catequina foi conjugada com dois antibióticos, nomeadamente o trimetoprim (TMP) e o sulfametoxazole (SMZ), através da ativação com N, carbonato de N, disuccinimidilo (DSC) e subsequente acoplamento às moléculas que contêm terminais α-amina. Os cateteres de PU e SI foram funcionalizados in-situ através da oxidação dos conjugados de catequina e antibióticos com lacase. Quatro revestimentos antimicrobianos foram produzidos, nomeadamente poli(catequina), poli(catequina)-TMP, poli(catequina)-SMZ e poli(catequina)-TMP-SMZ. A adesão bacteriana foi testada nos cateteres funcionalizados usando estirpes gram-negativas e gram-positivas. A redução da adesão bacteriana mais significativa foi observada com poli(catequina)-TMP (gram-negativa: - 85% e gram-positiva: - 87%) e poli(catequina)-TMP-SMZ (gram-negativa: - 85% e gram-positiva: - 91%). A citotoxicidade nas células de mamífero foi testada por contato indireto durante 5 dias e revelou que todos os revestimentos testados suportaram mais de 90% de células viáveis. Concluindo, neste trabalho foi desenvolvida uma nova abordagem promissora para aumentar o tempo de vida de cateteres invasivos, tendo como objetivo reduzir as infeções crónicas associadas aos cateteres. Processos envolvendo a combinação de lacase e ultrassons revelaram um grande potencial para áreas industriais com distintos tópicos de aplicação, permitindo a redução dos custos gerais de processamento, um menor impacto ambiental e a produção de novos produtos com novas ou otimizadas propriedades, contribuindo assim para a melhoria da qualidade de vida humana.