Functional characterization of mitochondrial suspensions by cytofluorimetric techniques towards the screening of mitochondrial target drugs

Abstract

Besides its role in respiration, mitochondria control other key metabolic pathways, cell proliferation and regulated cell death, with a crucial role in the regulation of the intrinsic apoptotic pathway. Recent studies have focused on the screen for anti-cancer agents that induce apoptosis through permeabilization of the mitochondrial outer membrane, leading to the cytosolic release of pro-apoptotic proteins and to the activation of the caspase cascade and consequently to cell dismantling. In the present study, staining protocols were developed and optimized aiming at the structural and functional characterization of isolated mitochondrial populations from yeast cells and rat liver by flow cytometry. Mitotracker Green and Nonyl Acridine Orange were used to measure changes in mitochondrial mass, 3,3'- Dihexyloxacarbocyanine Iodide and Mitotracker Red CMXROS to monitor the electrical potential of the inner membrane (Δψm), Mitotracker Red CM-H2XROS and Dihydroethidium to evaluate the accumulation of ROS, and 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)- 5-(and-6)-Carboxyfluorescein and Acetoxymethyl Ester (BCECF-AM) to measure the pH of the mitochondrial matrix. Subsequent flow cytometry studies were designed to evaluate the effect in mitochondria function of two well-known apoptosis inducers in both mammalian cell lines and yeast cells, namely bovine lactoferrin (bLf) and acetate, and to understand whether or not they act directly on mitochondria independently of upstream cellular pathways. The results showed that both bLf and acetate promoted changes in mitochondrial mass, matrix mitochondrial pH, Δψm and ROS levels of rat liver mitochondria. Moreover, the assessment of the activity of the complexes of electron transport chain (ETC) showed that bLf and acetate affect their activity and trigger mitochondrial swelling. These results are particularly interesting since the two compounds appear to induce in isolated mitochondria mainly the same alterations as those occurring in whole cells, and which have been proposed to be involved in the induction of cell death. Altogether, this study show that flow cytometry is a valuable tool to study key mitochondrial functional parameters and to screen for mitochondriatargeted drugs, including the anticancer agents, such as acetate and bLf.

Para além do seu papel na respiração celular, as mitocôndrias controlam outros aspetos chaves do metabolismo, bem como a proliferação celular e a morte celular regulada, tendo um papel crucial na regulação da via apoptótica intrínseca. Estudos recentes têm-se focado na procura de agentes anticancerígenos capazes de induzir apoptose mediada pela permeabilização da membrana mitocondrial externa, conduzindo à libertação de proteínas pró-apoptóticas e à ativação da cascata de caspases e consequente desmantelamento celular. No presente estudo, foram desenvolvidos e otimizados protocolos de marcação com vista à caracterização estrutural e funcional por citometria de fluxo de populações de mitocôndrias isoladas de células de levedura e de hepatócitos de rato. As sondas Mitotracker Green e laranja de nonil-acridina foram usadas para medir variações da massa mitocondrial, o iodeto de 3,3'-Dihexiloxacarbocianina e o Mitotracker Red CMXROS para medir o potencial eléctrico da membrana mitocondrial interna (Δψm), o Mitotracker Red CM-H2XROS e dihidroetídeo para avaliar a acumulação de ROS e o acetoximetil éster de (2',7'-Bis-(2- Carboxietil)-5-(and-6)-carboxifluoresceína e(BCECF-AM) para medir o pH da matriz mitocondrial. Os estudos subsequentes de citometria de fluxo foram desenhados para avaliar o efeito de diferentes drogas na função mitocondrial, em particular da lactoferrina bovina (bLf) e do acetato, dois reconhecidos indutores de apoptose, no sentido de se compreender se atuam diretamente na mitocôndria independentemente de outras vias celulares a montante. Os resultados mostraram que tanto a bLf como o acetato promovem alterações na massa mitocondrial, pH da matriz mitocondrial, Δψm e nos níveis de ROS em mitocôndrias isoladas de fígado de rato. Além disso, a avaliação da atividade dos complexos da cadeia de transportadora de eletrões (ETC) mostrou que a bLf e o acetato afetam a sua atividade e desencadeiam a tumefação mitocondrial. Estes resultados são particularmente interessantes uma vez que os dois compostos parecem induzir, em mitocôndrias isoladas as mesmas alterações que ocorrem em células inteiras, e que têm sido propostas como estando envolvidas na indução da morte celular. No seu conjunto, este estudo mostra que a citometria de fluxo é uma ferramenta valiosa para o estudo da funcionalidade mitocondrial e para o rastreio de drogas que têm como alvo a mitocôndria, incluindo agentes anticancerígenos, tais como a bLf e o acetato.