99mTc-PEI-MP e 188Re-PEI-MP para imagiologia e terapia de tumores malignos da bexiga: um estudo experimental

Abstract

Bladder cancer is the most common malignancy of the urinary tract, and is the fifth most common tumour world-wide, being responsible for about 2% of all cancer deaths. Current methods of diagnosis of the bladder cancer are mainly morphologic imaging techniques, while physiological imaging techniques, like nuclear medicine imaging that would enable to detect the disease in a very early stage, is not being fully availed for this type of cancer. The main methods to treat bladder cancer are aggressive and invasive to the patient, in a time where conservative management, with organ preservation, is now the standard of care in numerous malignancies. There is no reference to the use of radiopharmaceuticals for bladder cancer therapy, nevertheless, the existence of a specific radiopharmaceutical to bladder cancer could enable the delivery of high doses of radiation to the target tissue with minimal side effects, and some current therapy modalities could be substituted. Searching for a molecule for use in the palliative therapy of bone metastasis, the water soluble polymer polyethyleneiminomethyl phosphonic acid (PEI-MP), was synthesized. Pre-clinical studies performed with PEI-MP labelled with several radionuclides, demonstrated the high value of accumulation and retention by the bladder wall, which could demonstrate some affinity of PEI-MP to bladder cells, and possibly by bladder cancer cells. Thus, the aim of this work was to explore in vitro and in vivo the potential of PEI-MP radiolabelled with 99mTc or 188Re, for imaging and radionuclide therapy of bladder cancer. In a first stage it was prepared the PEI-MP kits for a quick and easy radiolabelling with 99mTc or 188Re, and to ensure high radiochemical purity. For in vitro studies, the cell lines of human bladder carcinoma (HT-1376) and human osteosarcoma (MNNG/HOS) were used. The osteosarcoma cells were used considering the original intent of using PEI-MP, and in order to make comparisons. Considering that PEI-MP should act only as a carrier for nuclear medicine imaging and therapy, cellular cytotoxicity of PEI-MP was analysed by the evaluation of the cellular metabolic activity and viability through spectrophotometry and flow cytometry. Cellular uptake and retention studies of 99mTc-PEI-MP and 188Re-PEI-MP were also performed. In vivo and ex vivo studies consisted on imaging and biodistribution studies performed in balb/c mice and balb/c n/nu mice with xenografts of bladder carcinoma and osteosarcoma, after the administration of 99mTc-PEI-MP and 188Re-PEI-MP. The PEI-MP kits demonstrated to be suitable for radiolabelling, allowing to achieve a high radiochemical purity over 5 hours, revealing the stability of the kit formulation. PEI-MP didn’t inhibit the metabolic activity or decreased the cell viability significantly and therefore would act as a carrier. Cellular uptake studies demonstrated that the uptake and retention of 99mTc-PEI-MP was, respectively, at least 5 and 4 times superior than the 99mTc-Pertechenetate for both cell lines. The same studies demonstrated that the uptake and retention of 188Re-PEI-MP was, respectively, at least 62 and 194 times superior than the 188Re-Perrhenate for both cell lines. These studies demonstrated the specificity of PEI-MP. In vivo and ex vivo studies demonstrated that 99mTc-PEI-MP and 188Re-PEI-MP were mainly excreted through the renal system and a small amount by enterohepatic circulation. Also it was confirmed the uptake of 99mTc-PEI-MP and 188Re-PEI-MP by lungs. The uptake of 99mTc-PEI-MP and 188Re-PEI-MP by the xenografts of bladder carcinoma or osteosarcoma, that demonstrated to be superior to 1 in relation to muscle, may be related not only with the blood perfusion to the tumour or the enhanced permeability and retention effect associated with PEI-MP, but also with the presence of specific membrane receptors in the case of bladder carcinoma and high concentrations of Ca2+ in both tumour types. Tumour/bladder, tumour/liver, tumour/lung and tumour/bone were always inferior to one. These results demonstrated that for diagnostic nuclear medicine a bladder carcinoma and its metastases would present as cold lesions allowing identifying them in the images. One the other hand the therapy of bladder carcinoma and its metastasis seem not to be feasible if administered intravenously, considering the high dosimetry to other organs.

O cancro da bexiga é a neoplasia maligna mais comum do trato urinário, e é o quinto tumor mais comum em todo o mundo, sendo responsável por cerca de 2% de todas as mortes relacionadas com o cancro. Os métodos actuais de diagnóstico para o cancro da bexiga são principalmente técnicas de imagem morfológicas, sendo que as técnicas de imagem fisiológicas, como as da medicina nuclear que permitiriam detectar a doença numa fase inicial, não estão ser totalmente aproveitadas para este tipo de cancro. Os principais métodos de terapia para o cancro da bexiga são agressivos e invasivos para o doente, numa época em que o tratamento conservador, com preservação de órgãos, é agora o padrão para o tratamento de diversas neoplasias. Não há nenhuma referência à utilização de radiofármacos para a terapia do cancro da bexiga, no entanto, a existência de um radiofármaco específico pode permitir a entrega de elevadas doses de radiação ao tecido alvo e com mínimos efeitos secundários, e algumas modalidades de tratamento actuais poderão vir a ser substituídas. Na procura de uma molécula para o tratamento paliativo de metástases ósseas, o ácido fosfónico solúvel em água polietilenoiminometil (PEI-MP), foi sintetizado. Estudos pré-clínicos realizados com o PEI-MP marcado com vários radionuclídeos, demonstraram uma elevada captação e retenção pela parede da bexiga, evidenciando a possível afinidade do PEI-MP para as células da bexiga e possivelmente para células de cancro da bexiga. Assim, o objetivo deste trabalho foi explorar in vitro e in vivo o potencial do PEI-MP radiomarcado com 99mTc ou 188Re, para a imagiologia e terapia com radionuclídeos do cancro da bexiga. Numa primeira fase, foram preparados os kits de PEI-MP para uma radiomarcação rápida e fácil com o 99mTc ou 188Re, e para assegurar a alta pureza radioquímica. Para os estudos in vitro, foram utilizadas as linhas celulares humanas de carcinoma da bexiga (HT-1376) e de osteossarcoma (MNNG/HOS). As células de osteossarcoma foram usadas tendo em conta a intenção inicial do PEI-MP, e de modo a fazer comparações. Considerando que o PEI-MP deve servir apenas como um veículo para a imagiologia e terapia de medicina nuclear, a citotoxicidade celular do PEI-MP foi analisada avaliando a actividade metabólica e viabilidade celular através da espectrofotometria e citometria de fluxo. Também foram realizados estudos de captação e retenção celulares do 99mTc-PEI-MP e 188Re-PEI-MP. Os estudos in vivo consistiram na realização de imagens e na análise da biodistribuição em ratinhos balb/c e balb/c nu/nu com xenoenxertos de carcinoma da bexiga e osteossarcoma após a administração de 99mTc-PEI-MP e 188Re-PEI-MP. Os kits de PEI-MP mostraram-se adequados para a marcação radioactiva, permitindo obter um elevado grau de pureza radioquímica 5 horas após a marcação, revelando a estabilidade da formulação do kit. O PEI-MP não inibiu a actividade metabólica ou diminuiu de forma significativa a viabilidade celular, podendo assim ser usado como um veículo. Os estudos de captação celular demonstraram que a captação e retenção do 99mTc-PEI-MP foi, respecivamente, 5 e 4 vezes superior à do 99mTc-pertecnetato para ambas as linhas celulares. Os mesmos estudos demonstraram que a captação e retenção do 188Re-PEI-MP foi, respectivamente, 62 e 194 vezes superior à do 188Re-perrenato para ambas a linhas celulares. Estes estudos demonstraram a especificidade de PEI-MP. Os estudos in vivo e ex vivo demonstraram que o 99mTc-PEI-MP e 188Re-PEI-MP são excretados maioritariamente por via renal e uma pequena quantidade pela circulação entero-hepática. A captação do 99mTc-PEI-MP e 188Re-PEI-MP pelos xenotransplantes de carcinoma da bexiga ou osteosarcoma, que demonstrou ser superior ao valor de um em relação ao músculo, pode estar relacionada não só com a perfusão de sanguínea para o tumor ou o efeito do aumento e permeabilidade e retenção associado ao PEI-MP, mas também com a presença de receptores de membrana específicos, no caso de carcinoma da bexiga e de concentrações elevadas de Ca2+ em ambos os tipos de tumores. As razões tumor/bexiga, tumor/fígado, tumor/pulmão e tumor/osso foram sempre inferiores ao valor de um. Estes resultados demonstraram que para o diagnóstico de carcinoma da bexiga e suas metástases em medicina nuclear, o tumor e as metástases surgiriam nas imagens como lesões frias, permitindo a sua identificação. Por outro lado, a terapia de carcinoma da bexiga e suas metástases parece não ser viável se administrado por via intravenosa, considerando a dosimetria elevada para outros órgãos.