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https://hdl.handle.net/1822/37301
Título: | Contribution to the study of plant responses to environmental stimuli in Arabidopsis thaliana and Quercus suber |
Autor(es): | Verde, Nuno Sérgio Sampaio e |
Orientador(es): | Castro, Pedro Humberto Azevedo, Herlânder Anselmo Queirós Pereira Tavares, R. M. |
Data: | 2015 |
Resumo(s): | Presently, environmental stress is the major threat for crop production and sustainability. Aggravation
of worldwide climate conditions has turned this matter into a research priority elevating the urgency to develop
new strategies that enable plants to cope with such challenges. One of Portugal’s major crops and source of
income is Quercus suber (cork oak) that produces cork for several industrial applications. Although this species
is moderately tolerant to drought and able to cope with Southern Europe’s climate, the continuous soil
impoverishment and scarcer precipitation has provoked a concern for product quality and long term
production. Efforts in unravelling this species’ mechanism to cope with such stresses have been made at the
ecological and physiological levels. The first part of this thesis is a review on the state of the Q. suber. It is also
addressed the optimization of an RNA extraction protocol designed to produce high quality RNA at high yields
from Q. suber tissues, that is ideal for downstream molecular applications.
Sugars are critical molecules that act, besides their energetic function, as protective elements against
environmental stresses, provide the carbon backbone of several organic molecules, and are essential in
primary metabolic pathways. Therefore, sugar production and consumption is tightly regulated and an
unbalance in sugar homeostasis can compromise plant survival. Sugars also act as signal molecules adjusting
cellular metabolism and their own synthesis, storage and usage. In the face of stress, plant survivability can
rely on quick and reversible post-translation modifications (PTMs) of existing proteins that remodel their activity.
One such PTM is carried out by the small ubiquitin-like modifier (SUMO) that is attached to target proteins
through an enzymatic sumoylation pathway similar to the ubiquitination system. Here, we explore the effect of
SUMO and sumoylation on sugar signalling and metabolism using the model plant Arabidopsis thaliana and the
SUMO E3 ligase mutant siz1. We observed that SUM1-conjugates accumulate in response to sugar treatment
in a SIZ1-dependent mechanism. The null siz1 mutant displays increased activity of sucrose and starch
catabolic genes, and shows reduced starch levels. Results placed SIZ1 in the control of germination time and
post-germination growth via osmotic and sugar-dependent signalling, respectively. Glucose was specifically
linked to SUMO-sugar interplay, with high levels inducing root growth inhibition and aberrant root hair
morphology in siz1. Additionally, the use of sugar analogues allowed us to demonstrate that SIZ1 is involved in
a glucose metabolism-dependent pathway. RT-qPCR analysis of siz1 mutants subjected to glucose treatment
revealed that HXK1 and ABA-responsive genes were up-regulated. These results suggest that SUMO is critical
for sugar perception and signalling. This new data was applied to create a molecular model of potential SUMOtargets
involved in sugar-related development and underlying hormone signaling. To further explore the SUMOsugar
interaction, novel molecular tools were also developed. The Arabidopsis HXK1 gene was cloned into
pET28 vector to overexpress in E. coli and then proceed to sumoylation assays. Additionally, HXK1 was also
cloned by Gateway system into pYFN43. This construct will allow to test, by BiFC, if HXK1 and SUM1 (cloned
into pYFC43) interact in planta and to establish a direct link between SUMO and carbohydrate signaling and
regulating enzymes. A maior ameaça à produção agrícola e sustentabilidade é o stresse imposto pelas condições ambientais deletérias ao normal desenvolvimento vegetal. O agravamento das condições climáticas tornou o estudo da biologia do stresse num dos campos de investigação prioritário. A espécie Q. suber, sobreiro, é um dos cultivares de maior positivo impacto socioeconómico em Portugal. Embora esta espécie seja moderadamente resistente à escassez de água comum no seu habitat natural, o contínuo empobrecimento dos solos e a baixa de precipitação ameaçam a qualidade do produto e a sua produção a longo prazo. Esta preocupação levou a esforços conducentes à elucidação dos mecanismos de tolerância ao stresse abiótico, através de estudos ecológicos e fisiológicos. Neste trabalho de tese pretendeu-se contribuir para elucidação dos mecanismos de tolerância ao stress abiótico. Os carbohidratos são moléculas essenciais que, para além das suas funções energéticas, funcionam como protectores contra stresses ambientais. Sendo fulcrais para o metabolismo primário, a sua estrutura de carbono serve de base a muitas moléculas orgânicas. A homeostasia dos açúcares é estritamente regulada, pois um desequilíbrio comprometeria a sobrevivência da planta. Os açúcares actuam, também, como moléculas-sinal, regulando o metabolismo, a sua síntese, armazenamento e consumo. Quando expostas ao stresse, as plantas contam com modificações pós-tradução que actuam rapidamente e de forma reversível sobre proteínas já existentes, remodelando a sua actividade. Uma destas modificações pós-tradução é efectuada pelo Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) que se liga a uma proteína alvo através de um sistema enzimático de sumoilação, semelhante ao sistema de ubiquitinação. Neste trabalho é explorado o efeito do SUMO e da sumoilação na sinalização e metabolismo de açúcares na espécie modelo Arabidopsis thaliana usando o mutante da SUMO E3 ligase siz1. Conjugados de SUM1 acumulam em resposta ao tratamento exógeno com açúcares de forma dependente de SIZ1. O mutante siz1 apresenta maior expressão de genes do catabolismo de sacarose e amido e, consequentemente, apresenta menores níveis de amido. Os resultados posicionam SIZ1 como regulador da geminação e do desenvolvimento pós-germinativo por via osmótica e sinalização de açúcares, respectivamente. A glucose, especificamente, em altas doses inibe o alongamento da raiz e induz a formação de pêlos radiculares anormais. O uso de análogos de açúcares demonstrou que SIZ1 está envolvido num mecanismo dependente do metabolismo da glucose. Análises por RT-qPCR de transcritos de plantas incubadas com glucose revelaram que HXK1 e genes de resposta a ABA se encontram sobreexpressos em siz1. Os resultados sugerem que SUMO é essencial para a perceção e sinalização de carbohidratos. Estes novos dados permitiram o desenvolvimento de um modelo molecular de potenciais alvos de sumoilação no desenvolvimento dependente de açúcares e na sinalização por hormonas subjacente. Para aprofundar a interacção SUMO-açúcares foram desenvolvidas ferramentas moleculares. O gene de HXK1 de Arabidopsis foi clonado no vector pET28 para ser sobreexpresso em E. coli e para efectuar ensaios de sumoilação. HXK1 foi também clonado por sistema Gateway em pYFN43. Esta construção irá permitir ensaios por BiFC com SUM1 para verificar interacções em planta, e assim estabelecer uma ligação direta entre SUMO e sinalização por carbohidratos e enzimas reguladoras. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Plant Molecular Biology, Biotechnology and Bioentrepreneurship |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/37301 |
Acesso: | Acesso restrito UMinho |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado CBFP - Dissertações de Mestrado DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses |
Ficheiros deste registo:
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Dissertação Nuno Verde.pdf Acesso restrito! | 4,51 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |