Síntese, atividade antifúngica e padrão de marcação em células de Saccharomyces cerevisiae de novos derivados fluorescentes de benzo[α]fenoxazina

Abstract

A presente dissertação compreendeu a síntese de seis cloretos de benzo[a]fenoxazínio funcionalizados com grupos éster etílico ou cloro, cujas propriedades fotofísicas em etanol e água foram determinadas. A preparação destes derivados do Nile Blue foi efetuada por reação de condensação em meio ácido dos compostos nitrosados de 3-aminofenol e 8- hidroxijulolidina com derivados da naftalen-1-amina, N-substituídos. Estes precursores foram obtidos por reação de alquilação do grupo amina do 3-aminofenol e da naftalen-1-amina, seguida da nitrosação dos derivados N-substituídos do 3-aminofenol. A atividade antiproliferativa dos compostos sintetizados foi determinada na levedura Saccharomyces cerevisiae PYCC 4072, utilizando o método de microdiluição descrito para os testes de suscetibilidade antifúngica em leveduras, em comparação com outros compostos estruturalmente relacionados. Todas as benzo[a]fenoxazinas testadas exibiram atividade antifúngica, com valores de MIC entre 0,78 μM e 400 μM. Considerando os valores de MIC determinados e os rendimentos quânticos relativos de fluorescência de todos os compostos, decidiu-se avaliar a capacidade de três benzo[a]fenoxazinas obtidos recentemente pelo grupo como sondas fluorescentes usando S. cerevisiae como organismo modelo. A microscopia de fluorescência foi usada para verificar a distribuição intracelular na levedura. Com o objetivo de determinar qual o organelo-alvo, foram feitos ensaios de co-localização usando leveduras transformadas que possuem genes que expressam proteínas, específicas de determinados organelos, e que estando ligadas à proteína fluorescente verde permitem identificar a sua posição intracelular. Adicionalmente, sondas fluorescentes comerciais, que acumulam especificamente em determinados organelos, foram também usadas de modo a confirmar os resultados obtidos. Os estudos efetuados ao longo deste trabalho revelaram que todos os compostos possuem uma elevada afinidade para a membrana do vacúolo, mostrando as potencialidades promissoras destes derivados de benzo[a]fenoxazina como sondas específicas para este organelo. Por outro lado, compostos com valores de MIC mais baixos, também acumularam na membrana do reticulo endoplasmático perinuclear, além da marcação da membrana do vacúolo. Por fim, procedeu-se ao estudo da interação de quatro compostos com dsDNA, por espectroscopia de UV-vis, tendo-se verificado que atuam por interações eletroestáticas com a superfície externa da molécula de DNA e/ou por intercalação.

Herein it is reported the synthesis of six benzo[a]phenoxazinium chlorides functionalized with ethyl ester or chloride, being their photophysical behaviour studied in ethanol and water. The preparation of Nile Blue derivatives was accomplished by condensation reaction of nitroso derivatives of 3-aminophenol and 8-hydroxyjulolidine with N-substituted naphthalen-1-amine in acid medium. The precursors were obtained by alkylation reaction of the amino group of 3-aminophenol and naphtalen-1-amine followed by nitrosation of N-substituted derivatives of 3-aminophenol. Their antimicrobial activity was evaluated against Saccharomyces cerevisiae PYCC 4072, in a broth microdilution assay performed in comparison with other related compounds of the same family. All tested compounds exhibited an antiproliferative activity with MIC values between 0.78 and 400 μM. Taking in account the MIC values obtained and the relative fluorescence quantum yields of all compounds, it was decided to evaluate the capability of three recently obtained benzo[a]phenoxazines as fluorescent probes using S. cerevisiae as a model organism. Fluorescence microscopy was used to determine their intracellular distribution. With the aim of identifying the stained organelles, co-localization experiments were performed using mutant yeasts carrying genes that express proteins which localize to specific intracellular location/organelles fused with green fluorescent protein. In addition, a commercially available fluorescent probe, which specifically accumulates in a known organelle, was also used in order to confirm the obtained results. Our studies revealed that all compounds have a high affinity to the vacuolar membrane, showing a promising future for benzo[a]phenoxazine derivatives as fluorescent probes specific to this structure. On the other hand, compounds with lower MIC values also accumulated in the perinuclear endoplasmic reticulum membrane, in addition to its accumulation in the vacuole membrane. Finally, the interaction of four of these compounds with dsDNA and their mode of binding were investigated by UV spectroscopy. Experimental results suggest that they interacted with the external surface of the DNA molecule by non-covalent interactions and/or by an intercalative binding.