Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/1822/39662

TitlePseudomonas aeruginosa diversification during infection development in cystic fibrosis lungs
Other titlesDiversificação da Pseudomonas aeruginosa no desenvolvimento de infeção em pulmões com fobrose cística
Author(s)Vaz, Raquel Alexandra Palas
Advisor(s)Pereira, Maria Olívia
Henriques, Ana Filipa Frutuoso Mendes
Issue date2015
Abstract(s)Cystic Fibrosis (CF) is a genetic disorder in which a defect in the cystic fibrosis conductance regulator (CTFR) occurs. This disorder affects many organs, the airways being one of the most affected. Patients with CF lung disease are very susceptible to chronic infections by various pathogens, one of them being Pseudomonas aeruginosa. This pathogen has a high ability of adaptation to the harsh environment found in CF lungs, characterized by inflammatory defences, antibiotic treatments, oxygen restriction, and poor availability of nutrients, among others. It is well established that once P. aeruginosa infection is installed in the lungs, it is almost impossible to eradicate. P. aeruginosa adaptation is achieved by some sophisticated mechanisms, as resistance to antibiotics, hypermutability, biofilm mode of growth, differential expression of virulence factors, and according to the stage of infection in the lungs and other genotypic and phenotypic changes. With the onset of chronic CF, P. aeruginosa diversifies into different morphotypes, with the emergence of mucoid phenotype and small colony variants (SCV) that are known to persist after continuous antibiotic treatment. P. aeruginosa adaptation under microaerophilic and anaerobic conditions was assessed in terms of growth kinetics, colony morphology, mutants frequency, pyocyanin production, antibiotic susceptibility, sub-population characterization and expression of mexA and 16S genes. Results showed, in both microaerophilic (10% CO2 and 5 % O2) and anaerobic environment, similar growth profiles and pyocyanin production. The emergence of intermediate susceptibility profiles by different strains for Ticarcilin/clavulanic acid, ciprofloxacin and imipenem was observed, as well as hypermutability, with anaerobic conditions. Phenotypic diversification was also observed, under all conditions, particularly in microaerophilic conditions with 5 % O2, with the appearance of morphotypes not identified before. Sub-populations characterization shown similar characteristics between morphotypes, with one morphotype standing out in terms of biofilm formation and antibiotic susceptibility. Results obtained with the regard of the effects of the decrease in oxygen tension on gene expression showed high levels of contamination of the RNA samples collected through the study to assess differential expression of mexA gene at different oxygen concentration. Also, it was found that both pair of primers used (16S and mexA) were not adequate for the tested strain, which translate in a lack of specificity and efficiency. Given the results of characterization of growth and phenotypic characteristics, is possible to conclude that oxygen depletion has no significant effect on P. aeruginosa growth, affecting, however, the phenotypic characteristics and antibiotic susceptibility profiles. Oxygen depletion increases the presence of intermediate resistant profiles, and strong mutator phenotypes, as observed in chronic infections. Microaerophilic environment seems to be a turning point of the stage of infection, as some distinctive characteristics were observed, as higher colony diversification, appearance of new sub-populations and slight decrease in antibiotic resistance profiles. In future studies of expression of mexAB-OprM efflux pumps, a more suited, or more than one, reference genes should be selected, as well as specific design of mexA primers for the strains used will be required. It is also recommended the treatment of RNA samples with acid phenol:chlorophorm to reduce possible DNA contaminations.
A Fibrose Quística (FQ) é uma doença genética que ocorre quando existe um defeito no cystic fibrosis conductance regulator gene (CFTR). Esta doença afeta vários órgãos, sendo as vias respiratórias as mais afetadas. Doentes com fibrose quística são muito suscetíveis a infeções provocadas por variados agentes patogénicos, tal como a Pseudomonas aeruginosa. Este agente patogénico possui uma grande capacidade de se adaptar ao exigente ambiente presente em pulmões de doente com fibrose quística, caracterizado pela presença de agentes inflamatórios, tratamentos com antibióticos, restrição de oxigénio e baixa disponibilidade de nutrientes, entre outros. É facto aceite que uma vez que a infeção crónica pela P. aeruginosa se encontre estabelecida, é praticamente impossível a sua erradicação. O processo de adaptação da P. aeruginosa é conseguido através de sofisticados mecanismos de resistência a antibióticos, hipermutabilidade, formação de biofilmes, expressão diversificada de fatores de virulência, de acordo com o estágio de infeção, entre outras alterações fenotípicas e fenotípicas. Com o estabelecimento de infeção crónica, a P. aeruginosa sofre uma diversificação em vários tipos morfologias (ou morfotipos), com o surgimento de um fenótipo mucoide e de small colony variants (SCV), conhecidas por persistir mesmo depois de continuamente sujeitas a tratamentos com antibióticos. Durante este trabalho, a adaptação da P. aeruginosa a condições de microaerofilia e anaerobiose, foi estudada relativamente à cinética de crescimento, morfologia de colónias, frequência de mutantes na população, produção de piocianina, suscetibilidade a antibióticos, caracterização de subpopulações e expressão genética do gene mexA. Os resultados obtidos demonstraram que, em ambos os ambientes de microaerofilia testados (com 10% CO2 e 5 % O2), bem como em anaerobiose, houve um crescimento semelhante das estirpes de P. aeruginosa, bem como uma constante produção de piocianina. Foi verificado o aparecimento de perfis intermédios de resistência, em diferentes estirpes, relativamente ao antibiótico TTC (Ticarcilina/ ácido clavulânico), CIP (ciprofloxacina) e IMI (imipenem), bem como o surgimento de hipermutabilidade com a exposição a condições anaeróbicas. Diversificação fenotípica foi também observada em todas as condições testadas, mas particularmente em 5 % O2, onde se verificou o aparecimento de morfotipos não observados anteriormente. Os diferentes morfotipos observados neste estudo, apresentam características semelhantes entre si, havendo no entanto um morfotipo (MT25) que se destacou no que diz respeito à formação de biofilme e suscetibilidade a antibióticos. Os resultados relativos ao efeito do decréscimo da concentração de oxigénio na expressão genética, mostraram um nível considerável de contaminação das amostras de ARN recolhidas durante o estudo da expressão diferencial do gene mexA em diferentes concentrações de oxigénio. Para além disso, concluiu-se que os primers usados neste estudo (mexA e 16S) não eram adequados pata a estirpe testada, o que se traduziu numa falta de especificidade e eficiência. Relativamente aos dados obtidos, é possível afirmar que a restrição de oxigénio não provoca um efeito significativo no crescimento da P. aeruginosa. Afetou, no entanto, as características fenotípicas e os perfis de suscetibilidade a antibióticos observados. A diminuição da disponibilidade de oxigénio provocou o aumento de perfis intermédios de resistência e o aparecimento de fenótipos hipermutantes, tal como verificado em infeções crónicas pela P. aeruginosa. A presença de condições de microaerofilia apresenta características que podem ser interpretadas como um ponto de evolução do estágio de infeção, dado que foram verificadas características distintas nesta condição, como uma maior diversificação de colónias, o aparecimento de novos morfotipos e um ligeiro decréscimo dos perfis de resistência a antibióticos observados. Em estudos a ser realizados futuramente, relativamente à expressão do operão mexAB é recomendado a seleção de um ou mais genes de referência, mais adequados ao estudo, bem como a o desenho dos primers para o gene mexA, específicos para a estirpe em uso. É também recomendado o tratamento das amostras de ARN obtidas com ácido fenol:clorofórmio, de modo a reduzir possíveis contaminações com ADN.
TypeMaster thesis
DescriptionDissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)
URIhttps://hdl.handle.net/1822/39662
AccessOpen access
Appears in Collections:BUM - Dissertações de Mestrado
CEB - Dissertações de Mestrado / MSc Dissertations

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Raquel Alexandra Palas Vaz.pdf2,95 MBAdobe PDFView/Open

Partilhe no FacebookPartilhe no TwitterPartilhe no DeliciousPartilhe no LinkedInPartilhe no DiggAdicionar ao Google BookmarksPartilhe no MySpacePartilhe no Orkut
Exporte no formato BibTex mendeley Exporte no formato Endnote Adicione ao seu ORCID