Algorithms and computational tools for metabolic flux analysis

Abstract

Metabolic Engineering (ME) is increasingly used to design strains for industrial biotechnology, using in silico constraint-based methods defined over genome-scale models to determine flux distributions in different conditions. However, these methods present a number of limitations related to multiple optima, futile cycles and reliance on cofactor balances. These can be overcome adding constraints to the systems, coming from experimentally measured rates. Valuable information is obtained from 13C tracer experiments, which allow to trace how labeling patterns propagate from substrates to products and how these relate to flux distributions through the application of 13C metabolic flux analysis (13C MFA). Although many software tools exist, none provides a free application that makes available the full portfolio of flux analysis methods. This work presents Constraint- Based Flux Analysis (CBFA), an open-source software application for flux analysis that implements several methods for phenotype prediction, allowing to define constraints related to measured fluxes and/or flux ratios, together with environmental conditions and gene knockouts. CBFA identifies the set of applicable methods based on the user inputs, encompassing algebraic and constraint-based methods. The integration within the OptFlux framework for ME enables to use different model formats and standards and the integration with complementary methods for phenotype simulation and visualization. To explore the information provided by 13C tracer experiments, a framework is developed that enables the integration of fluxomics data, as 13C labeling distributions, with models enriched with carbon atom transition maps. The algorithms allow to infer labeling distributions for fragments/ metabolites, building expressions for the relevant flux ratios. These can be used to generate flux ratio constraints to be added to flux analysis methods. This framework is generic not requiring any assumptions on the network or reaction reversibility. These algorithms were implemented in MetabolIc NEtwork Ratio AnaLysis (MiNeRAl), an user-friend generic tool to calculate metabolic flux ratios for any fragmentation used in GC-MS data. Both tools can thus be combined to perform tasks of 13C MFA.

A Engenharia Metabólica (EM) é cada vez mais utilizada para projetar estirpes para a biotecnologia industrial, utilizando métodos baseados em restrições in silico definidos sobre modelos à escala genómica para determinar distribuições de fluxos em diferentes condições. No entanto, esses métodos apresentam várias limitações no que diz respeito a múltiplas soluções óptimas, ciclos fúteis e confiança no balanceamento de cofactores. Estas podem ser ultrapassadas através da adição de restrições aos sistemas, obtidas pela medição de fluxos experimentais. Informação relevante é obtida através de experiências de rastreamento de 13C o que permite perceber como os padrões de marcação são propagados desde os substratos para os produtos, e como estes estão relacionados com fluxos através da aplicação de análise de fluxos metabólicos baseados em 13C. Embora existam muitas ferramentas informáticas, nenhuma fornece uma aplicação livre que disponibilize um portfólio completo de métodos de análise de fluxos. Este trabalho apresenta a aplicação de código livre, CBFA, para análise de fluxos que implementa vários métodos de predição de fenótipos, permitindo a definição de restrições relacionadas com fluxos medidos e/ou rácios de fluxos, juntamente com condições ambientais e deleções de genes. Esta aplicação identifica o conjunto de métodos aplicáveis com base nos dados introduzidos pelo utilizador, contendo métodos algébricos e baseados em restrições. A integração com o OptFlux, uma ferramenta para EM, permite o uso de diferentes formatos de modelos e a integração com métodos complementares de simulação de fenótipos e visualização. Para explorar a informação obtida das experiências de carbono marcado, foi desenvolvida uma ferramenta que permite a integração de dados de fluxómica, tal como distribuição de marcação de 13C, com modelos enriquecidos com mapeamentos de transição de átomos de carbono. Os algoritmos permitem inferir a distribuição de marcação para fragmentos/ metabolitos, construindo expressões para os rácios de fluxos relevantes. Estes podem ser utilizados para gerar restrições de rácios de fluxo para serem adicionadas à métodos de análise de fluxos. Esta ferramenta é genérica e não requer qualquer assunção sobre rede ou reversibilidades das reações. Estes algoritmos foram implementados no MiNeRAl, uma aplicação informática para calcular rácios de fluxos metabólicos para qualquer fragmentação utilizada em dados de GC-MS. Ambas as ferramentas podem ser então combinadas para a execução de análise de fluxos metabólicos baseada em 13C.