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https://hdl.handle.net/1822/40642
Título: | Searching for therapeutic strategies in a mouse modelo of Machado-Joseph disease: targeting proteostases |
Outro(s) título(s): | Rastreio de estratégias terapêuticas num modelo de ratinho da doença de Machado-Joseph: foco na proteostase |
Autor(es): | Silva, Sara Carina Duarte |
Orientador(es): | Maciel, P. |
Data: | 21-Dez-2015 |
Resumo(s): | Machado-Joseph Disease (MJD) belongs to the group of nine Polyglutamine (PolyQ) diseases, which are characterized by the appearance of misfolded protein species, protein aggregates, neuronal dysfunction and ultimately cell death, of which is triggered by the presence of an expanded CAG repeat in the respective disease-causing genes. Along with the pathogenic motif, all these disease-associated proteins are widely expressed but the diseases only affect specific subsets of neurons. So far there is no effective treatment available for these disorders. Because the pathogenic mechanism(s) underlying MJD are poorly understood, which might be hampering the progression of effective therapeutical targets, this work focused on the search for new therapies based on hypotheses, that additionally allow the study of molecular mechanism(s) of disease. For this, we used the CMVMJD135 mouse model, which recapitulates the human disease both at the phenotypic and neuropathologic levels. We tested the efficacy of several compounds acting on different aspects of cellular function: (i) molecular chaperone load, (Hsp90 inhibitor - 17-dimethyl aminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin hydrochloride - 17-DMAG); (ii) autophagy (lithium chloride and a combination of lithium chloride – LiCl - and temsirolimus - CCI-779); (iii) Endoplasmic reticulum (ER) stress response, (taroursodeoxycholic acid - TUDCA), also known to have multiple actions in the cells, and (iv) the energy status in the cell (creatine).
Chronic treatment of CMVMJD mice with 17-DMAG resulted in a delay in progression of the motor coordination deficits and a reduction in neuropathology. While we observed limited induction of heat-shock proteins with treatment, we found evidence that 17-DMAG could be acting through autophagy, as levels of LC3-II and beclin-1 were induced in the brain of treated animals. This resulted in decreased levels of the mutant ataxin-3 (ATXN3) and reduced intranuclear aggregation of this protein. To further test autophagy induction as potential therapeutic approach for MJD, we tested LiCl alone and a combination of LiCl with CCI-779 (m-TOR independent and dependent inducers, respectively). In spite of activating autophagy, as suggested by the increased levels of Beclin-1, Atg7, and LC3- II, and a reduction in the p62 protein levels, lithium had no overall beneficial effects in MJD model concerning motor performance. Furthermore, the combined therapy using LiCl and CCI-779 proved to be deleterious to both WT and transgenic animals, failing to rescue their neurological symptoms in the first and exerting in neurotoxic effects in the latter.
TUDCA is an orally bioavailable and BBB permeable bile acid with known neuroprotective action, through its anti-amyloidogenic and chemical chaperone activities and its ability to modulate apoptotic pathways. In addition, TUDCA is FDA-approved for chronic use in humans to treat liver disorders, but has also been shown to be beneficial in several models of different neurodegenerative diseases. In the CMVMJD135 model, TUDCA delayed the onset of disease and improved the motor phenotype, including balance, motor coordination and gait parameters, and ameliorated neurological reflexes, exploratory movement deficits and muscular strength problems. Although TUDCA treatment did not reduce the ATXN3 aggregate load in the brain, it normalized the RNA levels of TNF-α, Il1β and Il10 in the brainstem and reduced the astrogliosis in the substantia nigra and brainstem. These results demonstrated the therapeutic efficacy of TUDCA supplementation for MJD, most likely mediated by its anti-inflammatory properties, making this compound an attractive for the treatment of neurodegenerative diseases, including MJD.Lastly, we tested the efficacy of creatine, another naturally-occurring compound known to balance energy status in the cell. Creatine-supplemented diet led to an overall improvement in the motor phenotype of CMVMJD135 mice, namely improved motor coordination, limb strength and gait quality, and amelioration of some neurological parameters such as tremors and abnormal reflexes. Remarkably, chronic creatine treatment delayed the onset of several symptoms and, in some cases, completely abolished their appearance, supporting creatine supplementation as a useful strategy to slow the progression of MJD.
In summary in this work we validated a new MJD mouse model for use in preclinical trials as a powerful tool to study simultaneously pathogenic mechanisms associated with the disease and to develop novel therapeutic strategies. Furthermore, we found that Hsp90 inhibitors, TUDCA and creatine are relevant therapeutic candidates for MJD, some of which could be advanced to clinical trials in MJD patients. A doença de Machado Joseph (DMJ) pertence ao grupo de nove doenças poliglutaminas em que o gene causador da doença possui uma expansão anómala do codão CAG. A presença desta expansão conduz ao aparecimento de espécies proteicas com conformação incorreta, agregados proteicos, disfunção neuronal e consequentemente, morte celular. Para além da expansão, todos os genes associados a este grupo de doenças possuem expressão ubíqua apesar de só afetarem subconjuntos específicos de neurónios. Atualmente, não existe tratamento eficaz para a DMJ. Uma das razões pelas quais há um atraso no desenvolvimento de alvos terapêuticos está relacionada com o conhecimento incompleto do(s) mecanismo(s) de patogénese associados à DMJ. Assim sendo, o objetivo deste estudo centrou-se na procura de novas terapias, usando uma abordagem baseada em hipóteses, que pode também permitir o estudo dos mecanismo(s) moleculares da doença. Para tal, foi usado o modelo de ratinho CMVMJD135 que recapitula a doença humana a vários níveis, nomeadamente fenotípico e neuropatológico. Testámos a eficácia de diversos compostos com alvos terapêuticos relacionados com diferentes funções celulares: (i) níveis de chaperones moleculares (inibidor de Hsp90 – 17-dimetil aminoetillamino 17- demetoxigeldanamicina - 17-DMAG); (ii) autofagia (cloreto de lítio e combinação de cloreto de lítico –LiCL e temsirolimus - CCI-779); (iii) resposta ao stress do retículo endoplasmático (ácido tauroursodesoxicólico – TUDCA), com múltiplas acções celulares, e (iv) estado energético celular (creatina). O tratamento crónico com 17-DMAG no ratinho CMVMJD135 resultou num atraso da progressão da descoordenação motora e redução da neuropatologia. Apesar de ter sido observada uma indução limitada das chaperonas moleculares, este tratamento poderá ter atuado a nível da autofagia na medida em que houve indução dos níveis de LC3-II e beclina-1 no cérebro de animais tratados. Esta indução resultou na diminuição dos níveis de ataxina-3 (ATXN3) e uma redução da agregação intranuclear desta proteína. Para testar mais aprofundadamente a indução da autofagia como potencial terapia para a DMJ, foi testado LiCl isoladamente e em combinação com CCI-779 (atuando de forma independente e dependente da sinalização mTOR, respectivamente). Apesar da ativação da autofagia, sugerida pelos níveis aumentados de beclina-1, Atg7, LC3-II e redução dos níveis proteicos de p62, o tratamento do modelo DMJ com lítio foi de uma forma geral ineficaz ao nível do desempenho motor. Além disso, a terapia combinada de LiCl e CCI-779 revelou-se prejudicial em ambos os ratinhos WT e transgénicos, falhando na recuperação de sintomas neurológicos e sendo neurotóxico. O TUDCA é um ácido biliar com administração oral e permeável à BBB com funções neuroprotectoras conhecidas, através da sua capacidade anti-amiloidogénica, actividade de chaperona química e de modulação de vias apoptóticas. Adicionalmente, o TUDCA é um composto aprovado pela FDA para administração crónica no tratamento de doenças hepáticas, sendo também benéfico em diversos modelos de doenças neurodegenerativas. No modelo CMVMJD135, o tratamento com TUDCA atrasou o início da doença e melhorou o fenótipo motor incluindo equilíbrio, coordenação motora, e parâmetros da marcha, reduziu os reflexos neurológicos anómalos, melhorou os défices no movimento exploratório e força muscular. Apesar de o tratamento com este composto não ter reduzido os níveis de agregação da proteína ATXN3, foi eficaz na redução dos níveis de expressão de TNF-α, Il1β e Il10, tendo também reduzido a astrogliose no tronco cerebral e substantia nigra. Estes resultados demonstram a eficácia terapêutica da suplementação com TUDCA na DMJ, muito provavelmente através das suas capacidades anti-inflamatórias, o que torna este composto atrativo no tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a DMJ. Por fim foi testada a creatina, outro composto natural reconhecido pela eficácia em restabelecer o equilíbrio energético na célula. A dieta suplementada com creatina conduziu a uma melhoria geral no fenótipo motor do ratinho CMVMJD135; nomeadamente, melhorou a coordenação motora, força nos membros e qualidade da marcha. Também teve impacto positivo em parâmetros neurológicos como os tremores e reflexos anormais. Surpreendentemente, o tratamento crónico com creatina atrasou o início do aparecimento de diversos sintomas e até aboliu a presença de alguns, o que reinforça a suplementação com creatina como uma estratégica eficaz no atraso na progressão de DMJ. Em conclusão, este estudo validou o novo modelo DMJ de ratinho para ensaios pré-clínicos como uma ferramenta valiosa para estudar simultaneamente mecanismos patogénicos associado à doença e para desenvolver novas estratégias terapêuticas. Além disso foi demonstrado que inibidores da Hsp90, TUDCA e creatina são candidatos terapêuticos relevantes para a DMJ, alguns dos quais com possibilidade de avançarem para ensaios clínicos em doentes. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/40642 |
Acesso: | Acesso aberto |
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