Contributos para a elucidação do modo de ação de própolis português: o caso do própolis do Pereiro

Abstract

O própolis é uma mistura complexa resinosa e balsâmica produzida pelas abelhas em suas colmeias, particularmente por Apis mellifera L.. As abelhas usam própolis para construir locais asséticos para a postura dos ovos da abelha rainha, para revestir fendas e fissuras, como barreira contra invasores e para controlar a proliferação de microrganismos. Este produto natural exibe uma vasta gama de propriedades biológicas para aplicações terapêuticas, entre as quais se destacam as propriedades antibacteriana, antifúngica e antioxidante. O espetro das bioatividades varia com a localização geográfica da colmeia, com a flora local e o clima, estando associado à presença de compostos específicos como flavonóides, ácidos aromáticos e ácidos fenólicos. Com a perspetiva de utilização de própolis em várias aplicações futuras, o objetivo deste estudo passou por avaliar e comparar as propriedades biológicas de extratos etanólicos (EE) de amostras de própolis português recolhidas num apiário da Beira Alta (Pereiro, P) nos anos de 2010, 2011, 2012, 2013 e 2014. Utilizando como modelo biológico a levedura Sacharomyces cerevisiae foi avaliada a influência de própolis na viabilidade destas células eucariotas, quer em meio fermentativo quer respiratório. De modo a compreender o modo de ação do própolis do Pereiro, procedeu-se ainda à avaliação da sensibilidade de mutantes aos extratos em ensaios de viabilidade e procurou-se esclarecer qual a influência dos extratos no potencial da membrana mitocondrial, recorrendo-se para o efeito à citometria de fluxo. As atividades antibacteriana e antifúngica contra um painel de bactérias e leveduras de interesse clínico e biotecnológico foram igualmente avaliadas neste trabalho, utilizando-se o método de diluição em agar. As propriedades antioxidantes dos EE foram também caracterizadas, sendo avaliadas em ensaios de viabilidade - quer em condições de co- quer de pré-incubação com o agente oxidante H2O2 - e por citometria de fluxo. Para completar o presente estudo, procedeu-se ainda à avaliação do efeito genotóxico do própolis em células de S. cerevisiae através do ensaio cometa. Os resultados mostraram que os extratos de própolis do Pereiro são citotóxicos e genotóxicos em meio fermentativo, com a exceção do extrato preparado com a amostra colhida em 2012. Todos os extratos mostraram atividade antioxidante, quer em ensaios de viabilidade quer por citometria de fluxo. Em relação ao modo de ação dos extratos, os resultados sugerem uma influência do própolis na linha de defesa oxidativa, na via da biogénese e acidificação vacuolar, nos fenómenos autofágicos e na morte celular por apoptose. As diferenças nos espetros de atividade antimicrobiana mostraram-se significativas entre os diferentes extratos. Paralelamente, os extratos de própolis do Pereiro têm um comportamento antagónico, sendo fortes antioxidantes a baixas concentrações mas tóxicos para as células a concentrações mais elevadas. Apesar das diferenças em algumas atividades biológicas, estudos preliminares de caracterização química sugerem que os cinco extratos são muito semelhantes em termos dos compostos fenólicos que os constituem, variando apenas na sua concentração, mas uma análise mais aprofundada será necessária para identificar os compostos bioativos nas diferentes amostras. Tendo em conta os resultados obtidos, uma futura aplicação na indústria farmacêutica, cosmética e alimentar pode ser ponderada para o própolis do Pereiro.

Propolis is a resinous and balsamic complex mixture produced by bees in their hives, particularly by Apis mellifera L. Bees use propolis to build aseptic sites for queen bee´s egg laying, to fill cracks and fissures, as a barrier against invaders and to control the proliferation of microorganisms. This natural product has a wide range of biological properties for therapeutic applications, among which we highlight the antibacterial, antifungal and antioxidant activities. The spectrum of bioactivities is variable with the geographical location of the hive, with the local climate and flora. These activities are associated with the presence of high concentrations of specific compounds as flavonoids, phenolic acids and aromatic acids. With the prospect of using propolis in several future applications, the aim of this study was the evaluation and comparison of the biological properties of ethanol extracts (EE) of Portuguese propolis samples collected in an apiary at Beira Alta (Pereiro, P) in the years 2010, 2011, 2012, 2013 and 2014. Using Sacharomyces cerevisiae as biological model, the influence of propolis was evaluated in cells under fermentative or respiratory conditions by viability assays. In order to understand the mode of action of Pereiro propolis, the susceptibility of mutants to theses extracts was assessed in viability assays and the influence of the extracts on the mitochondrial membrane potential was further searched by flow cytometry. The antibacterial and antifungal activities against a range of bacteria and yeasts of clinical and biotechnological interest have also been evaluated in this work, using the agar dilution method. The antioxidant properties of the EEs were characterized too, being evaluated in viability assays - either in co-incubation or pre-incubation conditions with the oxidizing agent H2O2 - and by flow cytometry. To complete the present study, the genotoxic effect of propolis extracts was also tested using the comet assay in S. cerevisiae cells. The results showed that Pereiro propolis extracts are cytotoxic and genotoxic in fermentation medium, with the exception of the extract prepared from the sample collected in 2012. All the extracts showed antioxidant activity both in viability assays and flow cytometry. Regarding the mode of action of the ethanol extracts, the results suggest an influence of propolis in the oxidative defense line, in biogenesis and vacuolar acidification, at autophagic phenomena and cell death by apoptosis. The differences in the spectra of antimicrobial activity were significant for the five extracts. Simultaneously, Pereiro propolis ethanol extracts display an antagonistic behavior, being strong antioxidants at low concentrations but toxic to cells at higher concentrations. Although the differences in biological activities, preliminary studies of chemical characterization suggest that the five propolis extracts are very similar in terms of phenolic compounds, varying only in concentration, but a deeper analysis will be necessary to identify the bioactive compounds of the different extracts. Taking into account the results obtained, a future application in the pharmaceutical, cosmetic and food industries can be envisaged for Pereiro propolis.