Yarrowia lipolytica whole cells immobilization: impact on citric acid production

Abstract

Cell immobilization has been used as a strategy to solve the limitations of using suspended free cells in the medium. Whole cells immobilization has been used to improve yields and volumetric productivity of bioprocesses. The central aim of this work was to select and optimize immobilization systems for Y. lipolytica W29 that could be used in the citric acid production from glycerol. Whole-cells immobilization by entrapment into calcium alginate gel matrix and by adsorption on plastic material was studied, with particular focus on the entrapment method. Firstly, the effect of calcium alginate gel matrix composition was evaluated and the best conditions for cells retention were 3.3 % (w/v) of sodium alginate and 0.5 M of calcium chloride. Also, different sizes of gel spheres were tested (2 mm, 3 mm and 4 mm) and no significant differences on citric acid production were found, in the range of diameter tested. The influence of dry cell mass per mass of wet support in citric acid production was also analyzed and it was observed that, in the range of 5 to 16 mg of dry cell mass per gram of wet gel matrix, citric acid production kinetics was unchanged. However, in the experiments with free cells, citric acid production decreased with cell concentration increase (from 1.5 g∙L-1 to 3 g∙L-1 and 4.5 g∙L-1), due to citric acid consumption. The results demonstrated an improvement in citric acid production (5 g∙L-1) with immobilized cells, highlighting the advantages of immobilized cells instead of free cells suspended. After selecting the best conditions for cell immobilization, the influence of initial glycerol concentration on citric acid batch production was analyzed and for the range of values studied (40 g∙L-1 to 80 g∙L-1) no cellular inhibition by the substrate was observed. Furthermore, the use of crude glycerol as an alternative substrate was also analyzed and a similar citric acid production was obtained with this low-cost substrate as with pure glycerol. pH adjustment during the production of citric acid, revealed to be very important to increase the final acid concentration. The immobilization by adsorption of Y. lipolytica W29 in DupUm® was studied, however high level of cells desorption was observed during citric acid production that make difficult to discrimanete the experiments with free and immobilized cells. In fact, similar profiles of citric acid production were obtained in both systems.

A imobilização de células tem sido utilizada para promover o aumento dos rendimentos e da produtividade de bioprocessos. O objetivo central deste trabalho reside na seleção e otimização de um sistema de imobilização de Y. lipolytica W29 para ser utilizado na produção de ácido cítrico a partir de glicerol. Neste contexto, foi estudada a imobilização de células por inclusão numa matriz de alginato de cálcio e por adsorção num material de plástico, com particular ênfase na imobilização por inclusão. Primeiramente avaliou-se o efeito da concentração da matriz de alginato de cálcio foi e as melhores condições de retenção celular encontradas foram 3,3 % (m/V) de alginato de sódio e 0,5 M de cloreto de cálcio. Adicionalmente testaram-se diferentes tamanhos de esferas de alginato de cálcio (2 mm, 3 mm e 4 mm), não se tendo observado diferenças significativas na produção de ácido cítrico, na gama de diâmetros testados. A influência da razão de massa seca de células por massa húmida de suporte na produção de ácido cítrico foi também analisada, tendo-se observado que na gama de 5 a 16 mg de massa seca de células por grama húmida de gel, a cinética de produção de ácido cítrico manteve-se praticamente inalterada. No entanto, nas experiências em que foram utilizadas células livres, a produção de ácido cítrico diminuiu com o aumento da concentração celular (de 1,5 g∙L-1 para 3 g∙L-1 e para 4,5 g∙L-1), como resultado do consumo do ácido cítrico. Os resultados demonstraram um aumento na produção de ácido cítrico (5 g∙L-1) com células imobilizadas, salientando as vantagens na utilização de um sistema com células imobilizadas em vez de células livres. Após a seleção das melhores condições de imobilização, foi estudada a influência da concentração de glicerol (de 40 g∙L-1 a 80 g∙L-1) e não foi observada inibição celular pelo substrato. Além disso, comprovou-se a possibilidade de utilização de glicerol bruto como uma alternativa ao glicerol puro, tendo-se observado uma produção de ácido cítrico similar nas duas situações. O efeito do ajuste de pH no meio de produção foi também avaliado, revelando-se importante no aumento da produção de ácido cítrico. Finalmente foi estudada a imobilização por adsorção de Y. lipolytica W29 a DupUM®, tendo-se observado uma elevada dessorção de células durante a produção de ácido cítrico, o que dificulta a discriminação entre os ensaios com células livres e células imobilizadas. De facto, os perfis de produção de ácido cítrico foram semelhantes nos dois sistemas.