Three dimensional scaffolds based on electroactive polymers for tissue engineering applications

Abstract

Biomaterials play an increasingly prominent important role in the development and success of tissue engineering, particularly in the regeneration or reestablishment of tissue functions and organs. The improvement in the understanding of the role of biomaterials in the formation and regeneration of new tissue has promoted faster and more effective developments in this area. Biomaterials based on electroactive polymers have gained special interest in the scientific community for applications in tissue engineering, in particular for mechanosensitive tissues (bone, ligaments/tendons) and electroative tissues (brain cells, heart and muscles). Among them, piezoelectric materials show a strong application potential due to their ability to mimic specific biological environments through electrical stimulation. The main objective of this study was to produce scaffolds with different morphologies (fibers, particles and three-dimensional scaffolds) based on piezoelectric polymers, poly(vinylidene fluoride) (PVDF), poly(hydroxybutyrate) (PHB) and poly(L- lactic acid) (PLLA) for tissue engineering applications. Plasma treatments were also used to modify the wettability of the materials. Thus, PVDF samples were processed by electrospinning technique and plasma treatments were performed under oxygen atmosphere for different times and applied power, in order to modify the wettability of the hydrophobic fiber surface. It was observed that plasma treatments didn´t significantly change the average fiber diameter (~ 400 ± 200 nm) or the physicochemical properties of the membranes, in particularly the β-phase content (~ 80-85 %) and the crystallinity degree (42 ± 2 %), showing that this is a suitable method to obtain superhydrophilic membranes. PVDF microspheres were processed by electrospray technique. Among the different processing parameters, polymer concentration was the one that most influenced the microspheres formation. Microspheres with average diameter ranging between 0.81±0.34 μm and 5.55±2.34 μm with a β-phase content between 63-74 % and a degree of crystallinity between 45 and 55% were obtained from dilute or semi-dilute solutions. Cell viability assays demonstrated the potential of the PVDF microspheres for tissue engineering applications. Three dimensional scaffolds based on PVDF with different porosities were produced using three different methods: solvent casting with sodium chloride (NaCl), solvent casting and freeze extraction using nylon and poly (vinyl alcohol) (PVA) templates. Regardless of the processing method, the scaffolds showed polymer crystallization in the β-phase and a degree of crystallinity of ~ 45%. Mechanical tests demonstrated the suitability of the materials for tissue engineering applications. PHB membranes were processed by electrospinning and the influence of processing parameters on the size and distribution of fibers was studied. It was found that the average fiber diameter of the PHB membranes decreased with decreasing internal diameter of the needle and increased with increasing applied electric field and flow rate up to ~ 2.0 µm. The processing parameters didn´t affect the crystalline phase of the PHB membranes yielding a degree of crystallinity of 53%. Further, cell viability studies proved the suitability of the material for tissue engineering applications. Plasma treatments under argon and oxygen atmospheres were performed with thin films and PLLA membranes obtained by solvent casting and electrospinning, respectively. The average diameter of the fibers didn´t change significantly for argon (866 ± 361 nm) or oxygen (1179 ± 397 nm) treatments. However, it was found an increase of the roughness of the films. Surface wettability studies proved that plasma treatments allowed to obtain superhydrophilic or low contact angles on membranes and films, with no influence on cell viability. PLLA microspheres with sizes between 0.16 and 3.9 μm and a degree of crystallinity of 40% and composite PLLA microspheres with cobalt ferrite nanoparticles (CoFe2O4) in the range of 0.8 to 2.2 μm were produced by emulsifying an oil (PVA solution) in water. PLLA spheres proved to be more stable in alkaline environments compared to magnetic composite PLLA microspheres. Moreover, it was found that the introduction of nanoparticles promoted the amorphous state in PLLA. It was shown that PLLA microspheres with and without CoFe2O4 particles didn´t inhibit cellular viability. In conclusion, it was demonstrated the possibility of processing different electroactive polymers in the form of microspheres, fibers, membranes and three-dimensional scaffolds, as well as evaluated the possibility to modify their wettability. This work represents thus a relevant contribution for increasing the use of these materials in innovative strategies for tissue engineering.

Os biomateriais desempenham um papel cada vez mais proeminente no desenvolvimento e sucesso da engenharia de tecidos, nomeadamente na regeneração ou no restabelecimento da função de tecidos/órgãos do corpo humano. Os avanços registados relativamente à compreensão do papel dos biomateriais na formação de novos tecidos e na sua regeneração têm promovido uma maior rapidez e eficácia nos estudos desenvolvidos nesta área. Biomateriais à base de polímeros eletroativos têm despertado especial interesse na comunidade científica, para aplicações em engenharia de tecidos, nomeadamente para tecidos mecano-sensitivos (osso, ligamentos/tendões) e tecidos eletroativos (neurónios, coração e músculos). Em particular, materiais eletroativos à base de polímeros piezoelétricos apresentam uma forte potencialidade por serem capazes de mimetizar o ambiente biológico do tecido através de estímulos eletromecânicos. O principal objetivo do presente trabalho consistiu na produção de scaffolds com diferentes morfologias (fibras, partículas e scaffolds tridimensionais) baseados em polímeros piezoelétricos, o poli(fluoreto de vinilideno) (PVDF), poli(hidroxibutirato) (PHB) e o poli(L-ácido láctico) (PLLA) para aplicações de engenharia de tecidos. Igualmente, foram utilizados tratamentos de plasma para modificar a hidrofobicidade dos materiais. Deste modo, foram processadas membranas de PVDF pela técnica de electrospinning e realizados tratamentos de plasma sobre atmosfera de oxigénio para diferentes tempos de tratamento e potência aplicada de modo a modificar a molhabilidade da superfície hidrofóbica das fibras. Foi observado que o plasma não altera significativamente o diâmetro médio das fibras (~400±200 nm) nem as suas propriedades físico-químicas nomeadamente o conteúdo de fase β (~80-85%) e o seu grau de cristalinidade (42±2 %) demonstrando ser um método eficaz na obtenção de membranas superhidrofílicas. Microesferas de PVDF foram processadas pela técnica de electrospray. De todos os parâmetros estudados (concentração de polímero e parâmetros de processamento) verificou-se que a concentração de polímero é aquela que mais influência a formação de microesferas. Microesferas com diâmetros médios variando entre os 0,81±0,34 μm e 5,55±2,34 μm com um conteúdo de fase β entre os 63-74% e um grau de cristalinidade entre 45 e 55% foram obtidas através de soluções diluídas ou semi-diluídas. Ensaios de viabilidade celular demonstraram a potencialidade destas microesferas para aplicações m engenharia de tecidos. Scaffolds tridimensionais à base de PVDF com diferentes porosidades foram produzidos recorrendo a três métodos distintos: solvent casting – com cloreto de sódio (NaCl), solvent casting e extração a frio utilizando telas de nylon e poli(vinil álcool) (PVA). Independentemente do método de processamento utilizado, os scaffolds apresentam a fase β e um grau de cristalinidade de ~ 45 %. Ensaios mecânicos demostraram a viabilidade dos materiais para a aplicação em causa. Membranas de PHB foram produzidas por electrospinning, realizando-se igualmente um estudo da influência dos parâmetros de processamento no diâmetro e distribuição de fibras. Assim, verificou-se que o diâmetro médio das fibras de PHB diminui com o do diâmetro interno da agulha e aumenta com o aumento do campo elétrico aplicado e taxa de fluxo até ~2,0 μm. Os parâmetros de processamento não influenciaram a fase cristalina das membranas de PHB tendo sido obtido um grau de cristalinidade de 53%. Estudos de viabilidade celular comprovaram a sua potencialidade para aplicações na área de engenharia de tecidos. Tratamentos de plasma sobre atmosferas de árgon e oxigénio foram efetuados em filmes e membranas de PLLA obtidas por solvent casting e por electrospinning, respetivamente. O diâmetro médio das fibras não sofreu uma alteração significativa para o árgon (866±361 nm) nem para o oxigénio (1179±397 nm) tendo-se, no entanto, verificado um aumento da rugosidade dos filmes. Estudos de molhabilidade de superfície demonstraram ser possível obter membranas superhidrofílicas e filmes com um menor valor de ângulo de contacto, não influenciando a viabilidade celular. Microesferas de PLLA com tamanhos compreendidos entre os 0,16 -3,9 μm e um grau de cristalinidade de 40% e microesferas compósitas de PLLA com nanopartículas de ferrita de cobalto (CoFe2O4) na ordem dos 0,8-2,2 μm foram produzidas pelo método de emulsão de um óleo (solução de PVA) em água. Esferas de PLLA demonstraram ser mais estáveis em ambientes alcalinos comparativamente às esferas de PLLA magnéticas. Verificou-se que a introdução de nanopartículas promove o estado amorfo no PLLA. Foi demonstrado que as microesferas de PLLA com e sem partículas de CoFe2O4 não inibem a viabilidade celular. Em conclusão, testou-se a possibilidade de processar diferentes polímeros eletroativos nas formas de microesferas, fibras, membranas e scaffolds tridimensionais, sendo igualmente provada a possibilidade de modificar a sua molhabilidade. Este trabalho representa um contributo relevante para a crescente utilização destes materiais em estratégias inovadoras de engenharia de tecidos.