Encapsulation of probiotics envisaged for folate production in human intestine environment

Abstract

Malnutrition is a problem that still affects one in three Human Beings (International Food Policy Reasearch Institute, 2015). There are different reasons that can explain this problem, although the lack of some micronutrients, such as folate, can be associated with malnutrition in pregnant women, children, elderly people and in people consuming a limited diet (WHO, 2012; Who, 2014a, 2014b). This work is thus focused on the construction and characterization of a coated microcapsule system capable to be a continuous folate producer, once into the intestine. This system is mainly constituted by alginate capsules, coated with different materials through layer-bylayer assembly (LbL) and smaller than 100 µm. The coated microcapsules are meant to: a) host probiotic bacteria; b) pass as intact as possible through the gastrointestinal system; c) adhere to the intestine mucus layer; and d) exchange nutrients (probiotic activation) and products (mostly folates) in the intestine, by changing the porosity of a membrane induced by pH, whilst retaining probiotics. With this, we believe that: 1) the residence time of probiotics in the intestine will increase; 2) a possible inflammatory response, due to direct contact with new bacteria, will be avoided or at least reduced; and 3) natural folate will be directly produced and assimilated (increased bioavailability comparing with supplementation with synthetic forms such as folic acid). To construct a microcapsule smaller than 100 µm (to avoid the modification of sensorial effects on the food where it might be incorporated), extrusion and emulsification techniques were tested, but just the last technique was able to produce capsules smaller than 100 µm and capable to encapsulate probiotics. Different alginates were tested for probiotics protection and it was concluded that on the one hand alginate CR8223 would be fit as a more permeable microcapsule core, and on the other hand alginate CR8133 would be more suitable for an increased protection (less permeability), as a second coating. Furthermore, the design of the first and third coating layers was planned to: limit the continuous swelling of the alginate microcapsules that could lead to their total destruction, using Ɛ-PLL (2nd coating); resist to acidic media, to protect probiotics and adhere to epithelial cells in order to increase the residence time of the coated microcapsule, using chitosan (3rd coating). In order to predict the interaction of these materials, turbidity tests were performed and showed the existence of interactions between the polymers in a range of pH values that would be interesting for the work (pH = 2 and 7, i.e. stomach and intestine). After the coated microcapsule construction, these tests were complemented by FTIR and confocal imaging aiming at proving the adhesion of the several coatings. These tests showed the consecutive adhesion of each material, proving the establishment of interactions between them. The alginate|Ɛ-poly-Llysine| alginate|chitosan microcapsules (APACM) was demonstrated to be stable during in vitro gastrointestinal tests, as shown by confocal imaging. The capsules were also subjected to in vitro gastrointestinal tests, which showed that the APACM had the capacity to protect Lactococcus lactis cremoris (LLC) when in contact with acidic media. In fact, the free LLC cells just survived during 90 min, having a total loss of viability after that. Once encapsulated, however, there was a decrease of viability during the first hour but 6 Log CFU of LLC cells were kept viable during the rest of the experiment. The characterization of the different coated microcapsules’ sizes, alginate|Ɛ-poly-Llysine microcapsules (APM), alginate|Ɛ-poly-L-lysine|alginate microcapsules (APAM) and APACM, during contact with KCl-HCl and PBS solutions showed that they had an average diameter of 20 µm (app.) and 40 µm (app.) in each medium, respectively. These results proved that there was a swelling degree of approximately 2-fold, in APACM between an acidic and a neutral medium, which might influence the porosity of the system, creating a more permeable structure at neutral pH. Regarding the release kinetics results it was proved that the differently coated microcapsules behaviour was adequately described by a LSM model and the mechanisms involved in folic acid release were composed by Fick diffusion ( MF) and two or more relaxation processes ( MR). Free LLC folate production showed that the highest amount achieved by cumulative quantification was at 10 h, reaching 95.25 ± 26 µg.L-1. In order to validate the nutrients exchange capacity of APACM, these capsules containing LLC were tested, although there was no sufficient production of any compound (folate or lactic acid) to validate the system, possibly due to the lack of viability of the cells. Free L. plantarum was also tested and proved to be able to produce high amounts of lactic acid. The test to validate the APACM’s nutrients exchange capacity when containing L. plantarum, showed a production of 2 g.L-1 of lactic acid by encapsulated L. plantarum after 20 h. These results proved that the APACM was able to allow the entrance of nutrients, L. plantarum activation and the release of lactic acid. The study of APACM adhesion to the cells showed an adhesion of 38 % to HT-29 cells and 33 % to Caco2 cells. In conclusion, APACM characterization proved that all designed functions were working effectively and because of that we believe that this system might be a significant step forward to deal with folate malnutrition, e.g. being used to substitute the normal supplementation of foods with folic acid.

Atualmente, subnutrição é um problema que influencia um em cada três Humanos (International Food Policy Reasearch Institute, 2015). Há diferentes razões que podem explicar este problema, contudo a falta de alguns micronutrientes, como o folato, pode estar associado à subnutrição em grávidas, crianças, idosos e pessoas com uma dieta limitada (WHO, 2012; Who, 2014a, 2014b). Por causa disto, este trabalho científico tem como objetivos a construção e caracterização de uma microcápsula capaz de produzir folato no intestino Humano de uma forma contínua. Esta microcápsula, é maioritariamente constituído por alginato, revestido através da técnica de camadapor- camada (LbL) e possui um tamanho menor que 100 µm. A microcápsula, terá a capacidade de: a) imobilizar uma bactéria probiótica; b) transportá-la através do sistema gastrointestinal; c) aderir ao mucos intestinal; e d) alterando a sua permeabilidade por sensibilidade ao pH do intestino, ativar as bactérias imobilizadas, retendo-as no seu interior. Com isto, acreditamos que: 1) o tempo de residência dos probióticos no intestino irá aumentar; 2) uma possível resposta inflamatória, por contacto de novas espécies de bactérias com o intestino, será minimizada ou pelo menos reduzida; 3) o folato produzido pelos probióticos (natural) será diretamente assimilado, aumentando assim a eficiência na absorção desta vitamina em comparação com a suplementação com formas sintéticas, como o ácido fólico. Para construir uma microcápsula de diâmetro inferior a 100 µm, de forma a não alterar as propriedades organoléticas do alimento, foram testadas técnicas de extrusão e emulsificação, sendo que apenas a última técnica foi capaz de produzir capsulas do tamanho desejado. Diferentes alginatos foram testados, tais como CR8223 que provou ser mais eficaz para a formação do núcleo da microcápsula, já que apresentou características de maior permeabilidade. Pelo outro lado, o CR8133 mostrou ser menos permeável e por isso melhor para proteger os probióticos, sendo usado assim como uma segunda camada. O plano para a construção do sistema implicava que a primeira e terceira camada tivessem as respetivas características: limitar um inchamento constante da cápsula, que culminaria numa destruição total da estrutura, que poderia ser obtido com a Ɛ-PLL (2a camada); resistência a meios ácidos para proteger os probióticos, e adesão a células epiteliais, de forma a aumentar o tempo de residência da microcápsula, com quitosano (3ª camada). De forma a prever a interação entre os materiais referidos anteriormente foram realizados testes de turbidimetria, que provaram a interação entre eles em pHs que seriam interessantes para o trabalho (pH = 2 e 7, estômago e intestino). Depois da construção da microcápsula revestida, outros testes foram realizados para provar a adesão de cada camada, tal como FTIR e imagens por confocal, que demonstraram a consequente adesão de cada camada. A microcápsula alginato|Ɛ-poly-Llysina| alginato|quitosano (APACM), também provou, durante um teste de simulação digestiva, in vitro, que as camadas eram estáveis e tal facto foi provado por imagens em confocal. Estes mesmos testes foram também efetuados para aferir a capacidade da APACM proteger a bactéria Lactococcus lactis cremoris (LLC), do meio ácido, e provaram que quando livres existiu uma total perda de viabilidade ao fim de 90 min. No entanto, nas encapsuladas houve apenas uma diminuição durante a primeira hora, mantendo uma viabilidade de 6 Log CFU ao longo de todo o teste. A caracterização das diferentes microcápsulas revestidas com uma, duas e três camadas (APM, APAM e APACM), durante o contacto com as soluções de KCl-HCl e PBS, mostraram que houve um diâmetro constante de 20 e 40 µm (apr.), respetivamente. Estes resultados provaram que existia um inchamento constante de aproximadamente 2 vezes, entre as cápsulas nos diferentes meios referidos. Em relação às libertações de ácido fólico das diferentes microcápsulas revestidas, foi provado que em todos as microcápulas se verificam modelos de libertação por Fick ( MF ) e por dois ou mais relaxamentos ( MR ). Durante este trabalho foi também provado que a bactéria LLC possui uma produção de folato de 95.25 ± 26 µg.L-1 ao fim de 10 h. De forma a avaliar a capacidade de troca de nutrientes da APACM, a bactéria LLC foi testada, contudo não apresentou a produção de algum composto, folato ou ácido láctico, em quantidades suficientes para validar o sistema. L. plantarum livre foi testada e provou ser capaz de produzir grandes quantidades de ácido láctico. Assim, de forma a validar a capacidade de troca de nutrientes da APACM, houve uma produção de 2 g.L-1 de ácido láctico, por L. plantarum encapsulada, depois de 20 h. Estes resultados provaram que a APACM foi capaz de permitir a entrada de glicose, ativar a bactéria encapsulada ( L. plantarum ) e libertar o ácido láctico produzido. O estudo da adesão da APACM a células epiteliais provou que estas microcápsulas possuem características adesivas, já que conseguiram uma adesão de 38 % a células HT-29 e 33 % a células Caco2, em testes independentes. Em conclusão a APACM provou ter todas as funções planeadas e por causa disto, acreditamos que este sistema poderá ser uma solução para a suplementação de uma forma mais eficaz, substituindo o ácido fólico, de forma a combater a subnutrição.