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https://hdl.handle.net/1822/42979
Título: | O papel do "purinoma" na atividade dos miofibroblastos cardíacos: interação complexa entre transportadores, enzimas e recetores purinérgicos |
Autor(es): | Vinhas, Carla Adriana Araújo |
Orientador(es): | Costa, Maria Adelina Coelho Ribeiro Martins, J. A. R. |
Palavras-chave: | Fibroblastos cardíacos Miofibroblastos Proliferação e produção colagénio tipo I Purinas Cálcio intracelular Recetores purinérgicos P2 Cardiac fibroblasts Myofibroblast Proliferation and production of collagen type I Purines Intracellular calcium Purinérgic P2 receptors |
Data: | 2015 |
Resumo(s): | Os fibroblastos cardíacos (FC) desempenham um papel crucial na remodelação
cardíaca, nomeadamente nas alterações eletrofisiológicas e hemodinâmicas que seguem
o enfarte do miocárdio. Durante a isquemia e reperfusão miocárdica são libertadas
grandes quantidades de ATP e UTP, levando à ativação de diversos subtipos de
recetores P2Y (metabotrópicos) e P2X (ionotrópicos). Desta forma, os nucleótidos de
adenina e uracilo poderão desempenhar um papel crucial como mediadores da
sinalização autócrina e/ou parácrina entre FC e entre estes e os cardiomiócitos.
O fenótipo e a expressão de recetores purinérgicos P2 em culturas de FC de ratos
Wistar adultos foram confirmados por imunofluorescência aplicada à microscopia
confocal. As oscilações do cálcio intracelular ([Ca2+]i) foram monitorizadas usando um
leitor de microplacas (Synergy HT, BioTek) após incubação das células com uma sonda
fluorescente, Fluo-4NW (2.5 mM, 45 min a 37 ºC). A proliferação/viabilidade dos FC
em cultura foi monitorizada utilizando o ensaio MTT. A produção colagénio do tipo I
foi avaliada por histoquímica enzimática através da marcação com Sirius Red.
Os FC de ratos Wistar adultos em cultura exibiram um fenótipo de
miofibroblastos caraterizado pela imunorreatividade positiva contra o recetor do
domínio discoide 2 (DDR2) e a proteína contrátil do músculo liso (α-SMA). Estas
células apresentaram imunorreatividade contra os recetores P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y11,
P2Y12 e P2Y13. Os nucleótidos de adenina e uracilo (100 μM) aumentaram os níveis de
[Ca2+]i com a seguinte potência: UTP (51±1,6%, n=11) ≈ ATP (48±1,2%, n=16) >>
ADP (31±1,2%, n=15) ≈ UDP (28±1,8%, n=7). A incubação das culturas de FC com
ADP (3-300 μM, n=2-15) causou um aumento dos níveis [Ca2+]i dependente da
concentração, não sendo observado nenhum efeito atenuante na presença dos
antagonistas dos recetores sensíveis ao ADP, P2Y1, P2Y12 e P2Y13, respetivamente
MRS 2179 (10 μM, n=4), AR-C 66096 (0,1 μM, n=3) e MRS 2211 (10 μM, n=3).No
entanto o efeito produzido pelo ADP (100 μM, n=13) foi significativamente (p<0,05)
atenuado pelos antagonistas não-seletivos P2, suramina (100 μM, n=4) e RB-2 (100
μM, n=3).
O envolvimento de recetores sensíveis ao UTP, P2Y2 e P2Y4, foi avaliado
usando agonistas seletivos destes recetores, respetivamente MRS 2768 (10 μM, n=5) e
MRS 4062 (10 μM, n=7); enquanto o último mimetizou o efeito do UTP, o agonista seletivo P2Y2 foi ineficaz. O envolvimento do recetor P2Y4 no controlo dos níveis de
[Ca2+]i nos FC foi confirmado pela atenuação do efeito dos nucleótidos de uracilo (e.g.
UTP) e adenina (e.g. ATP, ADP) na presença de RB-2 (100 μM, n=7). O ADP (30 μM,
n=5) e o seu análogo estável, ADPßS (30 μM, n=8), aumentaram a proliferação e a
produção de colagénio do tipo I das culturas de FC. A proliferação induzida pelo
ADPßS foi atenuada (p<0,05) pelo antagonista seletivo do recetor P2Y1, MRS 2179
(300 nM, n=6), mas não pelos antagonistas dos recetores P2Y12 e P2Y13, AR-C 66096
(0,1 μM, n=6) e MRS 2211 (10 μM, n=6), respetivamente.
Os dados sugerem que os recetores P2Y1, P2Y4 e P2Y11 podem afetar de forma
diferencial os transientes de [Ca2+]i e a proliferação de FC. O recetor P2Y4 é o principal
responsável pela elevação rápida dos níveis de [Ca2+]i induzida pelo UTP, ATP e ADP.
Além disso, os resultados mostram que a ativação de recetores P2Y1 sensíveis ao ADP
possui um efeito proliferativo (pró-fibrótico). Cardiac fibroblasts (CF) play crucial roles in cardiac remodeling, electrophysiological changes and hemodynamic alterations following myocardial infarction. ATP and UTP are released in huge amounts during heart ischemia and reperfusion, strenghtening the activation of many subtypes of metabotropic P2Y and ionotropic P2X receptors. The adenine and uracil nucleotides may play a key role of autocrine/paracrine mediators. The phenotype and the expression of P2 purinoceptors in cultured CF from adult Wistar rats were confirmed by immunofluorescence confocal microscopy. Intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) oscillations were monitored in the time-lapse mode using a microplate reader (Sinergy HT, BioTek) after loading the cells with the fluorescent Ca2+ dye, Fluo- 4NW (2.5 μM, 45 min at 37ºC). CF proliferation/viability was monitored using the MTT assay. Type I collagen production was evaluated using the Sirius Red assay. Cultured CF from adult rats exhibit a myofibroblast phenotype characterized by positive immunoreactivity against discoidin domain receptor 2 (DDR2) and α-smooth muscle actin (α-SMA). These cells exhibit immunoreactivity against P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y11 P2Y12 and P2Y13 receptors. Adenine and uracil nucleotides increased [Ca2+]i oscillations. The rank potency order of the nucleotides (100 μM) was the following: UTP (51±8, n=11) ≈ ATP (48±9, n=16) >> ADP (31±10, n=15) ≈ UDP (28±7, n=7). Incubation of CF cultures with ADP (3-300 μM, n=2-15) concentration-dependently increased [Ca2+]I, not observed any effect in the presence of antagonists ADP-sensitive P2Y1, P2Y12 e P2Y13 receptors, respectively, MRS 2179 (10 μM, n=4), AR-C 66096 (0,1 μM, n=3) and MRS 2211 (10 μM, n=3). However the effect of ADP (100 μM, n=13) was significantly (p<0,05) attenuated by suramin (100 μM, n=4) and Reactive Blue-2 (100 μM, n=3). Involvement of UTP-sensitive P2Y2 and P2Y4 receptors were evaluated using MRS 2768 (10 μM, n=5) and MRS 4062 (10 μM, n=7), respectively; while the latter mimicked the effect of UTP, the P2Y2 agonist was ineffective. Involvement of the P2Y4 receptor was confirmed, because antagonism by Reactive Blue-2 (RB-2, 100 μM, n=7) was more effective than by Suramin (100 μM, n=10). UTP-induced [Ca2+]i oscillations were also attenuated by the P2Y11 receptor antagonist, NF340 (10 μM, n=12). ADP (30 μM, n=5) and ADPßS (30 μM, n=8) increased cells growth and type I collagen production in CF culture. ADPßS-induced proliferation was attenuated (p<0,05) by selective P2Y1, MRS 2179 (300 nM, n=6), but not P2Y12 and P2Y13 receptors with ARC 66096 (0,1 μM, n=6) and MRS 2211 (10 μM, n=6), respectively. Data suggest that P2Y1, P2Y4 and P2Y11 receptors differentially affect [Ca2+]i transients and proliferation of rat CF. P2Y4 receptor is the major responsible for the quick elevation of [Ca2+]i levels induced by UTP, ATP and ADP. Furthermore, results show that activation of P2Y1 possess a proliferative effect. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/42979 |
Acesso: | Acesso restrito UMinho |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses |
Ficheiros deste registo:
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