Advance gellam gum-based hydrogels for the treatment of diabetic foot ulcerations

Abstract

The incidence of Diabetic Foot Ulcerations (DFUs) is increasing with the emergent worldwide prevalence of Diabetes. DFUs pathophysiologies such as delayed and immature re-epithelialization, persistent inflammation, ischemia and neuropathy, hinder the healing of wounds which rapidly develop into DFUs. The main problematic of this chronic and overwhelming condition is the time of healing that may last months or lead to foot amputation due to non-healing. Hence, there is an urgent need to find an effective treatment for diabetic wounds. The remarkable capacity of hydrogels to absorb and retain water has been recognized as highly valuable in providing and maintaining wound moist. Furthermore, it is currently demonstrated that hydrogels per se, or carrying different bioactive agents and/or cells, are bioresponsive. In this thesis, we hypothesized that both naturally bioactive polymers and stem cell-carrying hydrogels would be suitable to target the characteristic DFUs pathophysiologies. Gellan gum (GG) hydrogels have been extensively studied for different biomedical applications. However, the reduced resilience to deformation, the lack of intrinsic cell-adhesive features and cellmediated degradation are not ideal for skin wound healing. The first aim of this thesis was to overcome these limitations. The absence of cell adhesion moieties was surpassed through two different strategies: microstructural rearrangement of GG hydrogels generating GG-based spongy-like hydrogels, and chemical addition of peptide cell adhesive sequences to GG previously modified with divinyl sulfone (GGDVS). Moreover, cell-mediated degradation was attained by intercalating a cell-degradable polymer, hyaluronic acid (HA), within the core of spongy-like hydrogels and using a dithiol crosslinker sensitive to metalloproteases. Overall, both spongy-like hydrogels and peptide-modified GGDVS hydrogels showed ameliorated mechanical performance that was also tuned by varying the crosslinker and polymer amount. The importance of creating two different GG-based matrices with hydrogels characteristic features relies on their individual properties that can be advantageous for treating skin wounds. Dried polymeric networks, before being hydrated to form the spongy-like hydrogels, can be stored off-theshelf and produced in any form or shape-fit according to the wound size. These low-cost and ready-touse dried materials have great ability to absorb the wound exudate. Moreover, dried polymeric networks can be re-hydrated with any water-based solution with/without cells or bioactive agents immediately before application into the wound. In addition to the ability of carrying cells or bioactive agents, GGDVS hydrogels have the advantage of being injectable, which might not be immediately recognized as relevant for skin applications but can be of great importance for the treatment of interdigital wounds. The capacity of spongy-like hydrogels to directly influence keratinocytes was addressed after the incorporation of Sepia officinalis eumelanin to attain a system of eumelanin sustained release. The ability of primary human keratinocytes to phagocyte Sepia officinalis eumelanin, which was then accumulated in cytosolic vesicles and nuclei surroundings, was demonstrated. Keratinocytes viability and maturation was not affected by the contact with eumelanin but cell morphology and cell proliferation was dependent on eumelanin concentration. A time- and eumelanin concentrationdependent reduction of the amount of ROS/RNS released by UVA/UVB irradiated hKCs pre-exposed to it was observed. Hence, the effects of eumelanin over keratinocytes can be advantageous to benefit skin healing. The possibility to confer an angiogenic intrinsic character to the GG matrices was investigated following two approaches, the entanglement of HA within GG polymeric networks (GG-HA) and the modification of GGDVS with T1 or C16 peptides, from CCN1 and laminin proteins, recognized by endothelial cells. The incorporation of HA within GG polymeric networks resulted in spongy-like hydrogels degradation by hyaluronidase and consequent formation of low molecular weight HA fragments capable to improve blood perfusion and neovascularization in mice ischemic hind limbs. Although the angiogenic potential of T1 and C16 peptides was not studied, endothelial cell adherence and spreading within GGDVS hydrogels modified with T1 or C16 peptides was dependent on the type and amount of peptide. Cells presented a cobblestone-like morphology within GGDVS hydrogels modified with the C16 peptide, while a polarized morphology was observed with the T1 peptide. Motivated by our previous results, a strategy that concomitantly modulates inflammation and angiogenesis, and promotes neoinnervation, was followed. Aiming to potentiate a secretome relevant for nerve regeneration, human adipose-derived stem cells (hASCs) were pre-cultured in GG-HA spongylike hydrogels under neurogenic conditioned or standard media prior transplantation into full-thickness skin wounds of diabetic mice. Faster wound closure and re-epithelialization was attained 4 weeks posttransplantation for the majority of the wounds, but a thicker and fully matured epidermis was observed for the stem cell-laden GG-HA spongy-like hydrogels. Moreover, a higher CD163+/CD86+ macrophages ratio was obtained for all the conditions, significantly higher for GG-HA materials with hASCs pre-cultured in neurogenic medium, revealing a switch from the inflammatory to the proliferative phase of wound healing. Neoinnervation was achieved with unconditioned stem cell-laden GG-HA spongy-like hydrogels but not with conditioned stem cells. Altogether the results obtained under the scope of this thesis gave interesting insights on the effects of the new GG-based matrices over mechanisms that are pivotal for wound healing. Furthermore, GG-based matrices, especially if used as part of an integrated approach that targets the different pathophysiologies of diabetic wounds, represent a promising approach to positively impact reepithelialization and modulate the inflammatory response towards its resolution, which seems to be determinant for a successful neoinnervation.

A elevada prevalência da Diabetes no Mundo está a fazer aumentar a incidência de úlceras do pé diabético. As várias fisiopatologias das feridas diabéticas, nomeadamente a re-epitelização atrasada e imatura, a inflamação persistente, a isquemia e a neuropatia, atrasam a cicatrização das feridas que facilmente evoluem para úlceras. A problemática deste tipo de feridas reside no tempo de cicatrização que em muitos casos pode demorar meses ou mesmo não cicatrizar, resultando na amputação do membro afetado. Deste modo, existe uma necessidade premente de um tratamento eficaz para as úlceras diabéticas. A capacidade de os hidrogéis absorverem e reterem água tem sido reconhecida como extremamente valiosa na manutenção da humidade em feridas. Para além disso, os hidrogéis per se, ou incorporando diferentes células e/ou agentes bioativos, têm originado respostas biológicas benéficas. Nesta tese, postulou-se uma estratégia que envolvesse o uso de hidrogéis com polímeros bioativos ou células estaminais direccionanda para o tratamento das patologias das feridas diabéticas. Os hidrogéis de goma gelana (GG) têm sido vastamente estudados para diferentes aplicações biomédicas. No entanto, a baixa resistência a deformações, a falta de capacidade para promover a adesão e aquisição da morfologia nativa das células no seu interior, e a falta de biodegradação, não são ideais para tratar feridas de pele. O primeiro objetivo desta tese foi superar estas limitações. A ausência de características que permitam a adesão e aquisição de morfologia nativa das células foi superada recorrendo a duas estratégias: o rearranjo microestrutural dos hidrogéis de GG, originando hidrogéis esponjosos de GG, e a adição química de sequências peptídicas, promotoras de adesão celular, ao polímero de GG previamente modificado com divinil sulfona (GGDVS). A biodegradação foi alcançada intercalando um polímero degradável, o ácido hialurónico (HA), na estrutura reticulada de GG, assim como utilizando um agente de reticulação sensível à ação de metaloproteases. Estas duas matrizes à base de GG adquiriram uma estabilidade mecânica superior aos hidrogéis de GG que também pôde ser modulada variando o agente reticulante e a quantidade do polímero. As propriedades individuais de cada uma das matrizes à base de GG são igualmente relevantes para o tratamento de feridas da pele. Os hidrogéis esponjosos de goma gelana podem ser mantidos e armazenados no estado seco que, após serem hidratados, re-adquirem a forma de um hidrogel esponjoso. Para além disso, o custo de produção destes materiais é relativamente baixo e podem ser produzidos sob qualquer forma e tamanho, de acordo com as especificidades da ferida. Estes materiais prontos a usar podem ser utilizados na sua forma desidratada para absorver o exsudado da ferida, ou hidratados com uma solução aquosa com/sem células ou agentes bioactivos, imediatamente antes da aplicação na ferida. Para além de poderem transportar células aderentes ou agentes bioactivos, os hidrogeis modificados GGDVS têm a vantagem de serem injetáveis, um fator de extrema importância para o tratamento de feridas interdigitais. Num contexto de cicatrização de feridas da pele, abordamos o efeito da libertação sustentada de eumelanina (extraída de Sepia officinalis) a partir de hidrogéis esponjosos de GG sobre queratinócitos. Foi demonstrada a capacidade dos queratinócitos humanos primários fagocitarem a eumelanina, que se acumulou tanto em vesículas do citoplasma como também à volta do núcleo. A viabilidade e maturação dos queratinócitos não foi afectada pelo contacto com a eumelanina, no entanto, a morfologia e a proliferação das células foram alteradas de um modo dependente da concentração. Por fim, a eumelanina, previamente internalizada por queratinócitos, reduziu as espécies reactivas de oxigénio libertadas após a exposição dos queratinócitos a radiação UVA/UVB, de um modo dependente da concentração e do tempo de exposição. Deste modo, os efeitos da eumelanina sobre os queratinócitos podem ser vantajosos para beneficiar a cicatrização das feridas da pele. A possibilidade de conferir um carácter angiogénico à matriz esponjosa de GG foi investigada através de duas estratégias: a intercalação de HA nas redes poliméricas de GG (GG-HA) e a modificação do GG com o grupo divinil sulfona e os péptidos de adesão T1 e C16, das proteínas CCN1 e laminina, que podem ser reconhecidos por células endoteliais. Os hidrogéis esponjosos contendo HA tornaram-se susceptíveis à biodegradação pela hialuronidase com consequente formação de fragmentos de HA de baixo peso molecular, que demonstraram ser capazes de melhorar a perfusão sanguínea e aumentar a neovascularização num modelo animal de isquemia. Apesar do potencial angiogénico dos péptidos T1 e C16 não ter sido estudado, as células endoteliais aderiram no interior dos hidrogeis modificados com os péptidos, de um modo dependente do tipo e quantidade de péptido. Enquanto que a morfologia das células endoteliais no interior dos hidrogéis com C16 aparentou ser mais arredondada, nos hidrogéis com T1 foi mais polarizada. Tendo em conta os resultados anteriores, uma estratégia que concomitantemente modulasse a inflamação e angiogénese, e que promovesse a neoinervação, foi considerada. De modo a aumentar o secretoma que potencia a regeneração nervosa, células estaminais do tecido adiposo foram precultivadas em meio neurogénico ou normal no interior de materiais esponjosos de GG-HA e transplantadas para as feridas diabéticas de um modelo animal. Relativamente ao controlo (sem material), houve um aceleramento do fecho da ferida e re-epitelização, assim como uma maior proporção de macrófagos com expressão CD163+/CD86+, de um modo significativo nas feridas tratadas com hidrogéis esponjosos contento células estaminais pré-condicionadas em meio neurogénico, indicativo de uma progressão da fase inflamatória para a fase proliferativa da cicatrização da ferida. Uma epiderme mais espessa e completamente maturada foi observada nas feridas tratadas com hidrogéis esponjosos contendo células estaminais. Por fim, uma maior neoinervação foi observada para a condição contendo células estaminais, contrariamente à condição contendo células estaminais condicionadas. Em suma, os resultados obtidos no âmbito desta tese forneceram indicações interessantes sobre os efeitos das novas matrizes de GG sobre mecanismos essenciais para a cicatrização de feridas. Do mesmo modo, as matrizes de GG, especialmente se usadas como parte de uma abordagem integrada direccionada para o tratamento das diferentes patofisiologias de feridas diabéticas, representam uma abordagem promissora capaz de promover positivamente a cicatrização de feridas, não só ao nível da re-epitelização, mas também modulando a resposta inflamatória promovendo a sua resolução, um efeito que aparenta ser determinante para uma neoinervação bem sucedida.