Caracterização de biomassa anaeróbica granular: análise qualitativa e quantitativa de imagem, hibridização com sondas genéticas (FISH) e técnicas histológicas

Abstract

O objectivo desta tese foi a caracterização de biomassa anaeróbia granular utilizando técnicas de análise quantitativa de imagem, de visualização em microscópio electrónico de varrimento, de identificação microbiana com sondas genéticas e de visualização usando técnicas histológicas. A análise quantitativa de imagem foi aplicada a biomassa granular proveniente de dois reactores do tipo manto de lamas. Num dos reactores tentava-se seguir um protocolo experimental que conduzisse à formação de grânulos e noutro reactor, devido ao tipo de substrato alimentado (ácido oleico), os grânulos previamente inoculados sofreram um processo de desgranulação. Os objectivos específicos do presente trabalho foram: (i) definir o protocolo de amostragem da biomassa no reactor de granulação, de modo a preservar a estrutura dos agregrados formados em todas as etapas do processo. (ii) definir o melhor método de aquisição da Imagem, de modo a obter a melhor e maior informação durante as etapas dos processos, (iii) quantificar e minimizar erros devido a processos de diluição das amostras. (iv) demonstrar a utilidade e mais valia de técnicas de análise quantitativa de imagem para monitorização dum processo de granulação e dum processo de desgranulação de consórcios microbianos anaeróbios, nomeadamente na medição da área projectada dos agregados, dos filamentos livres e do número relativo de partículas de pequenas, intermédias e grandes dimensões. A amostragem da biomassa do reactor foi optimizada, tendo-se construído uma sonda que se introduzia pelo topo do reactor e que permitia aspirar uma amostra preservando a integridade dos agregados. O estudo do efeito da diluição na quantificação dos parâmetros morfológicos e de tamanho atrás definidos permitiu concluir que para diluições elevadas há sistematicamente uma sobrestimação de todos os parâmetros e que a diluição óptima depende não só da concentração inicial de biomassa, mas também do seu estado de agregação e provavelmente da sua estrutura. Na definição da diluição óptima em cada um dos estudos realizados, recorreu-se a um parâmetro definido como percentagem de reconhecimento que mede a razão entre os objectos integralmente visualizados numa imagem e todos os objectos, incluindo os que se encontram na fronteira da mesma. A aplicação da análise de imagem a um processo de desgranulação permitiu quantificaras alterações de tamanho ao longo do processo e obter uma boa correlação linear entre parâmetros de análise de imagem tal como área de finos/área total (sendo os finos definidos como partículas com diâmetro inferior a 1 mm) e parâmetros baseados numa selecção física de tamanho e na análise dos sólidos. A aplicação da análise de imagem a um processo de granulação permitiu também quantificar as alterações de tamanho e morfológicas ocorridas nos agregados microbianos durante o processo Mediu-se a área média dos agregados e a área média de três fracções de tamanho de agregados definidas do seguinte modo: pequenos, entre 100 e 1000 μm² de área, correspondendo a um diâmetro equivalente entre 11.3 e 35.8 μm, intermédios, entre 1000 e 20000 μm² de área, correspondendo a um diâmetro equivalente entre 35.8 e 159.6 μm e grandes, superiores a 20000 μm² de área, correspondendo a um diâmetro equivalente superior a 159.6 μm. O número e o comprimento médio de filamentos livres também foram determinados para cada amostra analisada. A microscopia electrónica de varrimento permitiu avaliar a morfologia bacteriana do exterior dos agregados que se formaram durante o processo de granulação, verificando as principais alterações ao longo do mesmo. Observaram-se bactérias filamentosas semelhantes ao género Methanosaeta e agregados de cocos. Observaram-se também os agregados que se encontravam em fase de desgranulação. A aplicação de técnicas de hibridização com sondas genéticas à identificação de grupos de organismos nos grânulos em formação, permitiu dar uma informação meramente qualitativa. Os resultados obtidos são muito preliminares e utilizaram-se apenas duas sondas específicas de grandes grupos (ARC915 — para aqueobactérias e EUB338 para bactérias). Por fim, tentou-se uma abordagem de técnicas histológicas para localizar a presença de ácidos gordos de cadeia longa adsorvidos em agregados de biomassa anaeróbia. Utilizaram-se dois corantes, negro de Sudão e óleo vermelho e pelos resultados obtidos que são também preliminares pareceu que o óleo vermelho permitia obter melhores imagens.

The aim of this work was to characterize anaerobic granular sludge by using quantitative image analysis techniques, scanning electron microscope observations, fluorescent in-situ hibridization (FISH) and histological techniques. Quantitative image analysis was applied to granular sludge from two sludge blanket reactors (an Upflow Anaerobic Sludge Blanket - UASB and an Expanded Granular Sludge Bed — EGSB). The UASB reactor was set to produce granular sludge from a completely dispersed inoculum. In the other reactor and due to the substrate fed (oleic acid) the previously inoculated granular sludge suffered a process of disintegration. The specific aim of this part of the work was: (i) to define the best protocol to withdraw the biomass from the granulation reactor preserving its structure during all the process. (ii) to define the best way of image acquisition, in order to get the highest quality and quantity of information. (iii) to quantify and to minimize the errors due to the diluition processes. (iv) to demonstrate the usefulness of quantitative image analysis for monitoring processes of granulation and granules disaggregation, namely by measuring the projected area, the free filaments and the relative number of small, medium and big particles. Biomass sampling was optimized. A special device was constructed that allowed a sample to be taken from the reactor, preserving the integrity of the aggregates. The effect of the diluition on size and morphological parameters quantification led to the conclusion that for high diluitions, there is an overestimation of all parameters. Furthermore, the optimal diluition depends not only on the initial biomass concentration, but also on the size of the aggregates and possibly on they structure. Optimal diluition was defined by using a parameter denominated percentage of recognition that measures the ratio between the objects that are completely inside the image and all the objects, including those that are in the frontiers. The application of mage analysis to a process of granules disintegration allowed the quantification of size changes along the process. A good linear correlation was obtained between image analysis parameters such as fine area/total area (fines were defined as particles with a diameter smaller than 1 mm) and parameters based on a physical separation and solids determination. The application of image analysis to a process of granulation allowed the quantification of size and morphology along the process. The average area of the aggregates was measured as well as the average area of three ranges of size, defined as: small aggregates between 100 e 1000 mμ² of area, corresponding to equivalent diameters between 11.3 e 35.8 μm, medium aggregates, between 1000 e 20000 μm² of area, corresponding to equivalent diameters between 35 8 and 159.6 μm and big aggregates larger than 20000 μm² of area, corresponding to equivalent diameters higher than 159.6 μm². The number and the average length of the free filaments were also measured for each sample. Scanning Electron Microscopy (SEM) allowed the observation of the bacterial morphology during the process of granulation. Organisms similar to the genera Methanosaeta and Methanococus were observed. The disaggregated granules were also observed by SEM. The application of FISH techniques for the identification of groups of microorganisms in the granular sludge allowed only qualitative information. Preliminary results were obtained by using only two genetic probes (ARC915 for archaebacteria and EUB338 for bactéria). The last technique used was based on histological techniques and the aim was to localize long chain fatty acids adsorved onto anaerobic granular sludge. Two dyes were used: sudan black and red oil and by the preliminary obtained results, the oil red was better for that purpose.