Development of hyaluronic acid-doxorubicin nanogels

Abstract

Cancer is the leading cause of death in the world. Cancer research is continuously growing aiming to achieve more efficient therapies and early diagnostics. Different challenges arise, concerning the development of efficient drug delivery systems compared to conventional therapies, such as chemotherapy. New formulations promoting a controlled drug distribution, potentiating selective and efficient pharmaceutical actions, have been developed. Nanogels, produced by self-assembly of chemical modified natural polymers, are suitable for this purpose since they are able to encapsulate the hydrophobic drugs, physically or chemically. The use of labile linkages, to stabilize drugs, allows a selective drug release, such as pH-sensitive hydrazone. Doxorubicin is a drug currently used in chemotherapy, however, a major drawback remains its toxicity to healthy tissues, when used in high dosages, and the development of multi-drug resistance during prolonged treatment. Doxorubicin can be conjugated with hyaluronic acid, a natural polymer abundant in the human body, via hydrazone or amide linkages. The main goals of this work consist in the development of hyaluronic acid-based nanogels for cancer therapy with doxorubicin, as well as the incorporation of 𝘺-Fe2O3 into the nanogels to develop a theranostic formulation. Chemical modifications were performed on the hyaluronic acid to obtain an amphiphilic polymer grafted with doxorubicin via hydrazone or amide linkage. Doxorubicin content, average size and polydispersity index were evaluated. The most promising nanogels were further characterized concerning release profile at different pH, cytotoxicity and physical incorporation of 𝘺-Fe2O3. Hyaluronic acid-doxorubicin conjugates, via hydrazone, were produced in PBS pH 7.4, containing 22 μg DOX/mg, an average size of 100 nm and a polydispersity index around 0.5. The conjugation, via amide, was performed in DMSO, leading to a doxorubicin content of 29 μg DOX/mg, an average size of 70 nm and a polydispersity index around 0.45. The release studies indicated a satisfactory release at pH 5.0 (lysosomal pH) although exhibiting some release at pH 7.4 (extracellular pH). 𝘺-Fe2O3 stabilization into nanogels, designed as nanomagnetogels, lead to 0.6-0.9 mM of stabilized 𝘺-Fe2O3. Concerning the cytotoxicity assay performed using A549 cell line, hyaluronic acid-doxorubicin conjugate via amide presented a fast action and promoted a decrease in cell viability. In summary, hyaluronic acid-doxorubicin nanogels were produced using a pH-sensitive linkage, hydrazone, and amide linkage. The nanogels exhibited interesting characteristics for drug delivery applications envisaging more effective therapies, even though further optimizations are required. 𝘺-Fe2O3 incorporation was accomplished allowing imaging detection for diagnostic purposes or therapy evaluation along with the controlled drug release.

O cancro é a principal causa de morte no mundo. A investigação na área do cancro está em evolução contínua, e tem como objetivo alcançar terapias mais eficientes e diagnósticos precoces. Diferentes desafios vão surgindo, relativamente ao desenvolvimento de sistemas de entrega de fármacos eficientes em comparação com as terapias convencionais, como a quimioterapia. Têm sido desenvolvidas novas formulações que promovam uma distribuição controlada do fármaco, potenciando uma ação farmacêutica seletiva e eficiente. Os nanogéis, produzidos por auto-organização de polímeros naturais quimicamente modificados, são adequados para este objetivo, uma vez que permitem encapsular fármacos hidrofóbicos, de forma física ou química. O uso de ligações lábeis, para estabilizar os fármacos, permite uma libertação seletiva, tais como as ligações hidrazona, sensíveis ao pH. A doxorrubicina é um fármaco usado atualmente em quimioterapia, contudo, o seu maior problema é a toxicidade em tecidos saudáveis, quando usada em doses elevadas, e o desenvolvimento de multirresistência durante tratamentos prolongados. A doxorrubicina pode ser conjugada ao ácido hialurónico, que é um polímero natural abundante no corpo humano, através de uma ligação hidrazona ou amida. Os principais objetivos deste projeto consistem no desenvolvimento de nanogéis de ácido hialurónico e doxorubicina para tratamento do cancro, assim como a incorporação de 𝘺-Fe2O3 nos nanogéis, para o desenvolvimento de formulações teranósticas. O ácido hialurónico foi modificado quimicamente para se obter um polímero anfifílico, o qual foi conjugado com a doxorrubicina por ligação hidrazona ou amida. A quantidade de doxorrubicina ligada, o tamanho médio e o índice de polidispersidade foram avaliados. Os nanogéis mais promissores foram ainda estudados em ensaios de libertação a diferentes pH, citotoxicidade e incorporação de 𝘺-Fe2O3. Os conjugados de ácido hialurónico e doxorrubicina por ligação hidrazona foram produzidos em tampão PBS pH 7,4, contendo 22 μg DOX/mg, tamanho médio de 100 nm e um índice de polidispersidade de cerca de 0,5. A conjugação por ligação amida foi efetuada em DMSO, o que conduziu a um conteúdo de doxorrubicina de 29 μg DOX/mg, tamanho médio de 70 nm e um índice de polidispersidade de cerca de 0,45. Os estudos de libertação indicam uma libertação satisfatória a pH 5,0 (pH dos lissossomas), contudo a pH 7,4 (pH extracelular) verificou-se também alguma libertação. A estabilização de 𝘺-Fe2O3 nos nanogéis, designados de nanomagnetogéis, levou à estabilização de 0,6 a 0,9 mM de 𝘺-Fe2O3. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados com a linha celular A549, e o conjugado de ácido hialurónico por ligação amida apresentou uma atuação rápida e levou a um decréscimo na viabilidade celular. Em suma, foram produzidos nanogéis de ácido hialurónico e doxorrubicina usando uma ligação sensível ao pH, hidrazona, e ligação amida. Os nanogéis mostraram características interessantes para sistemas de entrega de fármacos, permitindo assim terapias mais eficientes, apesar de ainda serem necessárias algumas otimizações. A incorporação de 𝘺-Fe2O3 foi conseguida nos nanogéis, o que pode permitir a sua deteção por técnicas de imagem para diagnóstico ou para avaliação da terapêutica, ao mesmo tempo que se faz a libertação controlada do fármaco.