Development of a non-invasive approach for oral squamous cell carcinoma diagnosis

Abstract

Oral cancer is considered the sixth most common cancer worldwide. It is reported that 90% of the cases corresponds to oral squamous cell carcinoma (OSCC). Despite the progress in cancer research, the five-year survival rate remains low, mostly due to advanced stages of diagnosis and development of loco-regional recurrence. OSCC results from accumulation of numerous genetic and epigenetic changes, followed by clonal expansion. Therefore, one goal of this project was to characterize OSCC genetic and epigenetic profiles in order to find potential biomarkers that can be used to detect OSCC in early stages and also predict the disease progression. Moreover, since biopsy is an invasive and painful method, it is mostly used when there is a suspicion of malignancy. Consequently, it was also aimed to try to validate a non-invasive method for OSCC diagnosis and to follow up the patients. Taking into account the aims of this project, 65 samples from tumour tissues were acquired and analysed by MS-MLPA in order to detect the genetic and epigenetic alterations that can be associated with OSCC initiation and progression. Furthermore, 12 of this 65 samples were also analysed by aCGH. Regarding genetic events, the most frequent copy number variations (CNVs) detected by MS-MLPA were gains at chromosomes 16p and 19p, and losses at 3p, 9p and 11q. Additionally, the main rearrangements detected through aCGH were gains at chromosomes 3q, 8q and Xq, and losses at 3p,18q Yp and Yq. The methylation status of 25 genes was assessed and the results revealed that gene promotor methylation of WT1, PAX5, GATA5, MSH6 and RARβ represent good epigenetic biomarkers for OSCC. After the OSCC characterization, 59 samples acquired by scraping the tumour surface from the patients were also analysed by MS-MLPA. The results from this non-invasive method were compared with tumour tissue results and it was found agreement between the two samples in 60% and 72% of the genes analysed, as respects to CNVs and methylation status, respectively. These results were truly promising in an attempt to validate this non-invasive approach for screening the oral cavity and to follow up the patients diagnosed with OSCC. In order to discovery some potential genetic and epigenetic alterations that can be associated with early stages of disease and risk of develop tumour relapses or metastasis, 49 samples of the surgery resection margin were analysed by MS-MLPA. It was suggested that deletion of CDKN2A and methylation of TP53 and WT1 are initial alterations in the OSCC carcinogenesis process.

O cancro oral é considerado a sexta neoplasia mais comum a nível mundial, sendo que mais de 90 % dos casos correspondem a carcinomas do tipo epidermoide. Apesar dos avanços a nível tecnológico e clínico, a taxa de sobrevivência a cinco anos não melhorou significativamente nos últimos anos devido, essencialmente, ao diagnóstico tardio e à elevada taxa de recidivas locais ou metástases. Atualmente, sabe-se que o carcinoma epidermoide da cavidade oral (CECO) resulta da acumulação de alterações genéticas e epigenéticas, seguida de expansão clonal. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo a caracterização molecular do CECO na tentativa de encontrar potenciais biomarcardores que possam vir a ser úteis no diagnóstico precoce e na previsão da progressão da doença. Além disso, tendo em conta que a biopsia é um método invasivo e que causa desconforto, apenas é usado quando existe suspeita de malignidade. Consequentemente, através da realização deste projeto, pretendeu-se também validar uma metodologia não invasiva para diagnosticar o CECO e acompanhar os doentes. Tendo em conta os principais objetivos deste estudo foram inicialmente analisadas 65 amostras de tecido tumoral, recorrendo à metodologia MS-MLPA, na tentativa de encontrar as principais alterações genéticas e epigenéticas associadas com o CECO. Além disso, 12 dessas amostras foram também analisadas por aCGH. Considerando as variações genéticas, as alterações mais frequentes detetadas por MS-MLPA dizem respeito a ganhos localizados nos cromossomas 16p e 19p e perdas nos localizadas nos cromossomas 3p, 9p e 11q. Os resultados obtidos com a técnica aCGH demostraram maioritariamente ganhos nos cromossomas 3q, 8q e Xq e perdas nos cromossomas 3p, 18q, Yp e Yq. A metodologia MS-MLPA permitiu inferir o estado de metilação de 25 genes, levando a concluir que a metilação dos genes WT1, PAX5, GATA5, MSH6 e RARβ podem funcionar como biomarcadores para o CECO. Após a caracterização molecular do tumor foram analisadas, por MS-MLPA, 59 amostras provenientes da raspagem de células na região tumoral. A comparação destes resultados com os obtidos no tecido tumoral revelou que 60% dos genes analisados para o número de variação de cópias eram concordantes entre as duas amostras e, ainda, que o estado de metilação de 72% dos genes analisados também era concordante. Estes resultados demonstram ser promissores na tentativa de validação desta metodologia não invasiva. A análise de 49 amostras de tecido macroscopicamente não tumoral, contíguo ao tumor, permitiu sugerir que a deleção do gene CDKN2A e a metilação dos genes TP53 e WT1 são alterações iniciais no processo de carcinogénese do CECO.