Understanding the role of KRAS mutations in mitochondria regulation in the yeast model

Abstract

Cancer results from a multistep process, whereby carcinogenesis depends not only on factors from the environment but also from inside the cell, such as mutations, some of them inherited. The formation and development of colorectal carcinoma (CRC) is associated to several genetic changes, being KRAS hotspot mutations (KRASG13D/G12D/G12V) the most frequent events. KRAS is a proto-oncogene whose mutations may result in the constitutive (permanent) activation of KRAS protein and consequently of the signal transduction pathways in which KRAS is involved. It has been shown that KRASG12V proteins change their localization to the mitochondria upon an apoptotic stimulus. Mitochondria are central organelles in apoptosis but the mitochondria role in human KRAS mutant cells and if/how KRAS mutations play any role in apoptosis regulation, is not well established. In this work we aimed at unravel whether KRAS localizes to mitochondria, and somehow interferes with apoptosis. We also aimed to study whether KRAS regulates the pro-apoptotic Bcl-2 family member Bax at the level of the outer mitochondrial membrane, thus regulating apoptosis. In order to address this study, and given the significant similarities between yeasts and mammalian cells, yeast was used as a study model. Saccharomyces cerevisiae W303-1B ras2 expressing KRASWT and KRASG13D/G12D/G12Vhad already been established in our laboratory and were used in this work. Our results on yeast can contribute to better clarify the role of human KRAS mutations in the regulation of apoptosis through the mitochondrial pathway, namely the Bcl-2 family members, in CRC harbouring those mutations.

O cancro resulta de um processo com vários passos, no qual a carcinogénese depende não só de factores ambientais mas também de alterações no interior da célula, tais como mutações, algumas delas hereditárias. A formação e o desenvolvimento do carcinoma colo-retal (CRC) está associado a várias alterações genéticas, sendo as mutações do KRAS (KRASG13D/G12D/G12V) os eventos mais frequentes. O KRAS é um proto-oncogene cujas mutações podem resultar na ativação constitutiva da proteína KRAS e consequentemente da via de sinalização na qual o KRAS está envolvido. Foi igualmente descrito que a proteína KRASG12V humana, aquando de um estímulo apoptótico, altera a sua localização deslocando-se para a mitocôndria. A mitocôndria é um organelo central na apoptose mas o seu papel em células com o KRAS humano mutado e o modo como as mutações influenciam a apoptose, ainda não está descrito. Neste trabalho procurámos elucidar se o KRAS se localiza na mitocôndria, e de alguma forma interfere com a apoptose. Visámos também estudar se o KRAS regula a proteína próapoptótica Bax da família Bcl-2 ao nível da membrana mitocondrial externa, regulando assim a apoptose. Para levar a cabo este estudo, e dadas as semelhanças entre a levedura e as células de mamífero, a levedura Saccharomyces cerevisiae W303-1B foi usada como modelo de estudo. As estirpes W303-1B ras2 a expressar KRASWT e KRASG13D/G12D/G12V já tinham sido construídas no nosso laboratório e foram usadas para o presente estudo. Os nossos resultados em levedura podem contribuir para melhor esclarecer o papel das mutações no KRAS humano na regulação da apoptose através da via mitocondrial, nomeadamente por interação com membros da família Bcl-2 no CRC com estas mutações.