Characterization of vacuole permeabilization and HMGB1 nuclear release in the yeast cell death induced by a benzo[a]phenoxazine derivative

Abstract

The number of antifungal agents approved for use in humans is still very limited and resistance to the existing ones is often found, thus revealing the need for the development of new antifungal drugs. Phenoxazine derivatives have assumed an increasing importance in life sciences since they present antiproliferative proprieties which potentiate their utilization as antitumor and antimicrobial agents. We have recently found that one new phenoxazine derivative (MSG-111-cd3), induces cell death in Saccharomyces cerevisiae and accumulates at the vacuolar membrane and endoplasmic reticulum. Initial studies revealed that MSG-111-cd3 toxic effect may be mediated through vacuolar membrane damage and vacuolar permeabilization. Furthermore, it was observed that the compound lead to Nhp6Ap (the yeast HMGB1 orthologue) release from the nucleus to the cytosol, where it displayed a punctuated pattern, without loss of plasma membrane integrity. Aiming to further elucidate the cell death mechanism we analyzed the consequences of vacuolar permeabilization, the role of the HMGB1 protein in the cell death process and the mechanisms underlying its nuclear release. We find out that MSG-111-cd3 yeast cell death is dependent on the vacuolar protease Pep4p and that the vacuole permeabilization resulted in its translocation from the vacuole to the cytosol. We observed that autophagy is not involved in the cell death process, and although MSG-111-cd3 leads to mitochondrial network fragmentation, apparently, the cell death process is independent of the mitochondrial pathway, since no other alterations were significantly induced in this organelle. Our results suggest that Nhp6Ap is apparently not crucial for the cell death process. Furthermore, we found out that Nhp6Ap is not the only DNA binding protein to be released into cytosol, since the histone Hta2p also suffer translocation exhibiting the same phenotype as Nhp6Ap. Furthermore, the treatment lead to nuclear envelope disorganization, which show the high susceptibility of the nucleus to the MSG-111-cd3 effects.

O número de agentes antifúngicos aprovados para utilização em seres humanos é ainda muito limitado e é frequentemente encontrada resistência aos existentes, revelando assim a necessidade de desenvolvimento de novos fármacos antifúngicos. Os derivados de fenoxazina assumiram uma importância crescente nas ciências da vida, uma vez que apresentam propriedades antiproliferativas que potenciam a sua utilização como agentes antitumorais e antimicrobianos. Recentemente descobrimos que um novo derivado de fenoxazina (MSG-111-cd3) induz morte celular em Saccharomyces cerevisiae e acumula-se na membrana vacuolar e no retículo endoplasmático. Estudos iniciais revelaram que o efeito tóxico de MSG-111-cd3 parece ser mediado através de danos na membrana vacuolar e permeabilização vacuolar. Além disso, observou-se que o composto conduziu à libertação de Nhp6Ap (o ortólogo de HMGB1 em levedura) do núcleo para o citosol, onde apresenta um padrão pontuado, sem perda da integridade da membrana plasmática. Com o objetivo de melhor clarificar o mecanismo de morte celular induzido pelo composto MSG-111-cd3, analisamos as consequências da permeabilização vacuolar, o papel da proteína HMGB1 e os mecanismos subjacentes à sua liberação nuclear em resposta ao tratamento com este composto. Descobrimos que a morte das células de levedura causada pelo composto MSG-111-cd3 é dependente da protéase vacuolar Pep4p e que a permeabilização do vacúolo resultou na sua translocação para o citosol. Observamos que a autofagia não está envolvida no processo de morte celular e, embora o MSG-111-cd3 leve à fragmentação da rede mitocondrial, aparentemente, o processo de morte celular é independente da via mitocondrial. Os resultados sugerem que Nhp6Ap aparentemente não é crucial para o processo de morte celular. Além disso, mostrámos que Nhp6Ap não é a única proteína de ligação ao DNA a ser libertada do núcleo para o citosol, uma vez que a histona Hta2p também sofre translocação exibindo o mesmo fenótipo que Nhp6Ap. Além disso, o tratamento conduz à desorganização do envelope nuclear, o que mostra a elevada suscetibilidade do núcleo aos efeitos do MSG-111-cd3.