Immune tolerance dissected by single-cell transcriptomics

Abstract

O conjunto de mecanismos que protege o organismo de agentes patogénicos tem de ser agressivo o suficiente para destruir microorganismos e parasitas. Consequentemente, isto torna-o potencialmente perigoso para os tecidos do hospedeiro. Assim sendo, têm de existir estratégias e pontos de controlo que evitem que o sistema imunitário reconheça antigénios do organismo ou antigénios externos mas inofensivos. Esta capacidade de não responder a determinados antigénios é designada por tolerância imunitária, e tem de ser assegurada especialmente a nível células T, uma vez que são elas as que coordenam grande parte das respostas imunitárias. Parte deste controlo é exercido durante o desenvolvimento das células T no timo, por um processo de selecção negativa conduzido por células tímicas epiteliais medulares (mTEC). As mTEC são especialmente intrigantes pela sua capacidade de expressar ectopicamente genes próprios de outros tecidos (antigénios restritos a tecidos, TRAs) para o exibirem às células T em desenvolvimento. A intensidade com que as células T reconhecem os péptidos apresentados pelas mTEC condiciona o destino das primeiras: se a ligação for fraca, podem sobreviver uma vez que não são auto-reactivas; se a ligação for muito forte, são eliminadas; ligações com força intermédia podem ser encaminhadas para um tipo celular particular, as células T reguladoras (Treg). Estas últimas actuam posteriormente nos tecidos periféricos, exercendo uma função anti-inflamatória, impedindo nomeadamente que células T auto-reactivas que possam ter escapado à selecção negativa montem uma reacção imunitária contra antigénios próprios. Ambos estes tipos celulares, mTEC e Treg, têm sido estudados exaustivamente com o objectivo geral de compreender e potencialmente manipular o processo de tolerância imunitária. Além de ambas terem em comum um papel relevante no mesmo processo, e de defeitos em qualquer uma delas originarem problemas de auto-imunidade e inflamações crónicas, ambas as populações carecem de uma caracterização exaustiva com resolução célula-a-célula que permita identificar potenciais subpopulações e seus fenótipos. Assim sendo, usei métodos recentes para analisar o transcriptoma de células individuais (single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) de forma a esclarecer a estrutura, desenvolvimento e funções de populações de mTECs e Tregs. Em relação às mTEC, isolei células de ratinho sem enriquecer para nenhuma subpopulação conhecida, e obtive dados de scRNA-seq usando uma plataforma microfluídica comercial. Com estes dados, por agrupamento hierárquico, identifiquei três subpopulações dentro do compartimento das mTEC - jTEC (Pdpn-positivas), mTEChi (níveis de Aire elevados) e mTEClo (níveis de Aire reduzidos) - que aparentam corresponder a fases consecutivas do desenvolvimento deste tipo celular, de acordo com a expressão do gene regulador Aire e a capacidade das mTEC em expressar TRAs. Foi a primeira vez que estas subpopulações foram identificadas e caracterizadas sem recurso a marcadores adicionais, como MHCII, durante a citometria de fluxo. Esta estratégia dá uma nova perspectiva nomeadamente do estado pós-Aire (mTEClo), que aparece como um mediador activo e potente de tolerância imunitária, capaz de expressar TRAs tão ou mais eficientemente que as paradigmáticas mTEChi. A análise de correlações entre genes, associada a análise de enriquecimento de locais de ligação de factores de transcrição, permitiu ainda a identificação de potenciais novos reguladores do desenvolvimento das mTEC (Vdr, Plagl1, Zbtb7a, Hnf4g). As Treg, por seu lado, representam um desafio bastante diferente. A importância das populações de Treg em tecidos não-linfóides (NLTs) é agora clara, quer na manutenção da tolerância imunitária face a auto-antigénios e outros antigénios inofensivos, quer em funções não-imunitárias, como regulação de metabolismo e regeneração de tecidos. Assim sendo, foquei-me em caracterizar as populações presentes em NLTs de ratinho, nomeadamente na lamina propria do cólon e pele, e compará-las com as suas equivalentes em tecidos linfóides (nódulos linfáticos que drenam os tecidos e o baço). Usando células T de memória (Tmem) como referência, defini quais os genes que caracterizam exclusivamente NLT Treg ou que são comuns a outros tipos de células T nos NLT. Também pude definir quais as diferenças e semelhanças entre as Treg na pele e no cólon. Modelando os dados computacionalmente, estabeleci ainda a ordem pela qual estas adaptações aos NLT são adquiridas pelas Treg aquando do seu recrutamento para os tecidos, quer em homeostase, quer durante uma perturbação imunitária (neste caso, indução de melanoma). As semelhanças entre os vários tecidos e condições são consideráveis, sugerindo um programa de recrutamento e adaptação geral das Treg ao ambiente não-linfóide, que é ligeiramente ajustável ao NLT específico. Verifiquei ainda que estas adaptações começam a surgir ainda no nódulo linfático que drena o tecido. Por último, confirmei que vários dos marcadores identificados para NLT Treg podem ser usados em humanos. Em resumo, dados de scRNA-seq foram usados de forma bastante distinta para esclarecer dois processos e tipos celulares fundamentais na tolerância imunitária, que de outra forma permaneceriam confundidos em análises a nível de populações.

The set of mechanisms that protects the organism against pathogens needs to be efficient to destroy invading microorganisms and parasites. Consequently, this makes it potentially dangerous for the host’s tissue. Therefore, strategies and checkpoints have to be in place to avoid the production of immune responses against self-antigens or harmless external antigens. This ability, named immune tolerance, has to be enforced mainly at the level of T cells, as they coordinate most immune responses. An important part of this control is exerted during T cell development in the thymus, through a remarkable process of negative selection conducted by medullary thymic epithelial cells (mTECs), which ectopically express tissue-restricted antigens (TRAs) to present to the developing T cells. The strength of the signal elicited upon recognition of self-peptides conditions the fate of T cells: a weak signal allows T cells to survive, as they are not self-reactive; a strong signal leads to their elimination; a moderate signal can lead to the development of a particular T cell subtype, the regulatory T cells (Treg). These cells later act on the peripheral tissues by exerting anti-inflammatory influence, blocking self-reactive conventional T cells that might have escaped negative selection. Both cell types, mTEC and Treg, have thus been extensively studied in order to understand and eventually control and fine-tune immune tolerance. However, both populations have been missing a comprehensive characterization, namely with single-cell resolution, which would allow the identification of subpopulations and their phenotypes. Therefore, I employed state-of-the-art methods to analyse the transcriptome of individual cells (single-cell RNA sequencing, scRNA-seq), so that the structure, development and functions of mTEC and Treg populations could be clarified. Murine mTECs were sorted without enrichment for any known maturation stage, and single-cell data was generated using a commercial microfluidic plaform. By hierarchical clustering, I identified three subpopulations within the mTEC compartment - jTEC (Pdpn-positive), mTEChi (Aire-high) e mTEClo (Aire-low) - that appear to correspond to consecutive phases of mTEC development, according to the expression of the Aire transcription factor and each subpopulation’s capacity to express TRAs. For the first time, these subpopulations were identified and characterized using an unbiased approach, i.e. without using additional flow cytometry markers. This approach gives a new perspective of the post- Aire state (mTEClo), which emerges as an active and potent driver of immune tolerance, capable of expressing TRAs at least as efficiently as the paradigmatic mTEChi. Gene-gene correlations, coupled with transcription factor-binding motif enrichment, I identified potential new regulators of mTEC development (Vdr, Plagl1, Zbtb7a, Hnf4g). Treg, on the other hand, represented quite a different challenge. Their importance in non-lymphoid tissues (NLTs) is now clear, both in maintaining immune tolerance to self and other harmless antigens, and in eliciting non-immune functions, as metabolism regulation and tissue regeneration. Therefore, I focused in characterizing the NLT Treg populations in mouse, namely in the colonic lamina propria and skin, and comparing them to their lymphoid tissue counterparts (draining-lymph nodes and spleen). Using memory T cells (Tmem) as a reference, I define the gene signatures that exclusively characterize NLT Treg, or that are shared with other T cell types in the NLTs. I also define the differences and similarities between skin and colon Treg. Computational modelling allowed me to establish the order by which NLT adaptations are acquired during their recruitment to the tissues, both in steady-state and during an immune challenge (namely, during melanoma induction). The similarity between tissues and conditions is quite significant, suggesting the existence of a general programme of recruitment and adaptation to the non-lymphoid environment that can be fine-tuned to each specific NLT. I also verify that such adaptations start to arise still in the respective draining-lymph nodes. Finally, I confirm that several of the identified NLT Treg markers can be used in the human context. In summary, scRNA-seq data was used in quite distinct ways to clarify processes and cell types fundamental for immune tolerance, which would otherwise remain confounded in analyses at the population level.