Study the roles of human galectin-3 using the yeast Saccharomyces cerevisiae and colorectal cancer cells as eukaryotic models

Abstract

Galectins are lectins characterized by a conserved CRD with a high affinity for β-galactosides. When localized extracellularly, they mainly interact with glycans on the surface of the cells, promoting cell-cell adhesion, the onset of immune response, and the recognition and clearance of pathogens. When intracellular, they interact with other proteins, modulating cell proliferation, cell cycle progression and apoptosis. The focus of the present work was galectin-3, the only chimera type galectin, aiming at turning the yeast Saccharomyces cerevisiae into a suitable model to study the roles and mechanisms of action of gal-3. Specifically, the work intended to assess the ability of extracellular gal-3 to recognize and bind yeast cells, as well as the ability of intracellular gal-3 to interfere with yeast cell survival and proliferation, in particular when interacting with the oncoprotein KRAS. The work also aimed at uncover the role of gal-3/KRAS/p16INK4a axis regulation in colorectal cancer (CRC) cells. Thus, both S. cerevisiae and human cancer cell lines were used as eukaryotic models. The effects caused by gal-3 on yeast biological processes were compared with those caused by other galectins with different structure and number of CRDs (the proto-type gal- 1 and gal-7, and the tandem repeat gal-4). S. cerevisiae and Candida albicans were used, as species with a very different biology, and because C. albicans was the only yeast in the literature tested in regard to gal-3. Each galectin caused a different pattern of effects, generally stronger on S. cerevisiae than on C. albicans. Gal-3 decreased viability and increased cell size, ROS level and DNA alterations, but did not induce membrane rupture, plasmatic nor mitochondrial, indicating that the stress it induces is not associated with cell death (necrotic or programmed). Gal-3 effects were mostly caused by its CRD (as shown using the truncated version of the galectin), and mediated by the Ras/cAMP/PKA pathway (demonstrated using the S. cerevisiae mutants). Gal-4 and gal-7 increased the levels of ROS and membrane rupture, without affecting viability. Gal-1 did not induce any significant alteration. A microarray-based analysis of the binding ability of galectins, in accordance with the results above, showed that all galectins except gal-1 bound to whole cells of S. cerevisiae and C. albicans, more efficiently to S. cerevisiae, in particular the correspondent Δras2 mutant and cell wall and membrane sub-cellular fractions. A S. cerevisiae-based high throughput platform (HTP) expressing human gal-3 and KRAS was built with the purpose of achieving the expression of both human cDNAs in the same strain. This is meant to enable in vivo study of the functional relations between the two proteins, and to serve as a HTP for pharmacological screening of drugs/molecules targeting either gal-3, KRAS or their interaction. Two different genetic backgrounds were used (W303- 1A and BY4741), wild type as well as Δras1 and Δras2 mutants. Gal-3 expression was fully achieved, altering growth rate and chronological life span. These phenotypes depended on the presence of Ras1 and/or Ras2. Human KRAS expression in wt yeast also caused phenotype variations, decreasing yeast resistance to various stress stimuli, most possibly due to the hyperactivation of the Ras/cAMP/PKA pathway. The double expression of gal-3 and KRAS in the same S. cerevisiae strain was attempted using several cloning strategies, and will be pursued in the future. Bearing this goal in mind, as well as the potential use for which the platform was built, human CRC cell lines were used to better understand the gal-3/ KRAS interaction and their role in CRC progression. The pivotal interaction of gal-3 and KRAS were confirmed, and a third protein was shown to belong to this regulation axis, p16INK4a. The three proteins physically interacted and co-localized in CRC cells, and there seems to be a reciprocal regulatory mechanism that might control their expression levels, adjusting it to the growing needs of the cancer cell. In conclusion, this work breaks through several boundaries: (i) galectins bind to yeasts, (ii) the binding is specific, (iii) it causes also specific responses from the yeast cell, (iv) these are mediated by Ras pathway, and (v) once intracellular, gal-3 induces different responses still mediated by Ras pathway. Importantly, in opposition to the scarce literature available, the work showed S. cerevisiae to be more sensitive than C. albicans, stressing the straindependent specificity of galectins recognition, at the same time discarding the suggestion that gal-3 might have the role of distinguishing between pathogenic and non- pathogenic yeasts in vivo. Moreover, p16INK4a was identified as a new member of KRAS/gal-3 regulation axis in CRC cells. All taken, the work launched the foundations for assuming and using S. cerevisiae as a model to study gal-3.

As galectinas são proteínas caraterizadas por possuírem um domínio de reconhecimento de carbohidratos (CRD) com elevada afinidade para β-galactosídeos. Quando no meio extracelular, as galectinas interagem com glucanos na superfície das células, promovendo reconhecimento e adesão, a resposta imunitária e a eliminação de patogéneos. Intracelularmente, as galectinas interagem com outras proteínas modulando a proliferação e o progresso do ciclo celular e a morte celular programada. O trabalho focou na galectina-3, o único membro da família das galectinas quiméricas. O objectivo do trabalho foi transformar a levedura Saccharomyces cerevisiae num modelo celular para estudar os papéis da gal-3. Para isso foi verificada a habilidade da gal-3, quando extracelular, de reconhecer à célula de levedura, quando intracelular, de interferir com a sobrevivência e capacidade proliferativa da levedura, muito em particular em relação à oncoproteína KRAS. O trabalho tinha também como objetivo perceber o papel da regulação do eixo of gal-3/KRAS/p16INK4a em células de cancro colorretal (CCR). Neste contexto foram usados a S. cerevisiae e células de cancro humano como modelos eucariotas. Os efeitos da presença extracelular de gal-3 foram comparados com os causados por outras galectinas com diferentes estrutura, as gal-1 e gal-7 do grupo de galectinas proto-tipo, e a gal-4 do grupo de galectinas repetição em tandem. Os efeitos destas galectinas foram comparados em estirpes de S. cerevisiae e Candida albicans, que foram escolhidas pela sua distinta biologia, e porque C. albicans era a única espécie de levedura referida na literatura sobre efeitos de galectinas em leveduras. Cada galectina provocou uma combinação de efeitos diferente, que foram genericamente mais fortes em S. cerevisiae do que em C. albicans. Em particular, gal-3 diminuiu a viabilidade da levedura e aumentou o tamanho das células, os níveis de ROS e as alterações no DNA, mas não induziu ruptura de membranas, plasmática ou mitocondrial, indicando que gal-3 induz stress sem acionar nenhum processo de morte celular, necrótica ou programada. A utilização de uma gal-3 truncada no terminal N mostrou que o CRD é suficiente para induzir os efeitos observados. A utilização de leveduras mutadas nos genes RAS mostrou que a gal-3 opera através da via Ras/cAMP/PKA. Em comparação, gal-1 não induziu qualquer efeito significativo, enquanto as gal-4 e gal-7 provocaram respostas que sugerem uma resposta de stress genérica. Através de um ensaio de binding microarrays com células de levedura inteiras e fracções sub-celulares, verificou-se que todas as galectinas, excepto gal-1, se ligam à parede e membrana de S. cerevisiae e C. albicans, mais eficientemente de S. cerevisiae, e mais ainda ao mutante Δras2 desta levedura. Foi construída uma plataforma de estirpes de levedura exprimindo os cDNA de gal-3 e KRAS humanos, com o objectivo de obter a expressão conjunta destas duas proteínas. A plataforma destina-se ao estudo das suas funções e interação, bem como a servir de ferramenta para ensaios em larga escala de moléculas e drogas farmacológicas dirigidas para a gal-3, o KRAS, ou para a sua interação. Foram usadas leveduras de dois fungos genéticos distintos (W303- 1A e BY4741), selvagens e mutantes defectivos nos genes RAS1 e RAS2. A expressão da gal-3 em levedura alterou a taxa de crescimento e o envelhecimento cronológico na dependência da via Ras/cAMP/PKA. A expressão do KRAS em levedura também provocou alterações de comportamento na extirpe selvagem devidas possivelmente à sobre-ativação da mesma via. A obtenção de uma estirpe exprimindo simultaneamente gal-3 e KRAS foi tentada usando várias estratégias de clonagem, e será possivelmente alcançada no futuro. Tendo em conta os objectivos a que se destina a plataforma, foram usadas células de CCR. A interação da gal-3 e KRAS foi confirmada e demonstrou-se interação deste complexo com a p16INK4a. Estas três proteínas interagem fisicamente e colocalizam em células de CCR, parecendo haver um mecanismo de regulação reciproca que parece controlar os seus níveis de expressão, ajustando-os mediante as necessidades de crescimento da célula de cancro. Em conclusão, o trabalho quebra barreiras mostrando: (i) que as galectinas se ligam às células de levedura, (ii) de forma específica, (iii) induzindo respostas também específicas, (iv) mediadas pela via Ras, (v) igualmente quando a gal-3 é expressa intracelularmente em S. cerevisiae. Em oposição à escassa literatura disponível, mostrou-se que S. cerevisiae é mais sensível que C. albicans, sublinhando a influência da estirpe na especificidade da resposta e ligação às galectinas, e afastando a sugestão de que gal-3 possa exercer in vivo uma função discriminatória entre leveduras patogénicas e não-patogénicas. Além disso, foi identificada a p16INK4a como um novo membro do eixo de regulação KRAS/gal-3 em CCR. Globalmente o trabalho lançou as fundações para a utilização da levedura S. cerevisiae como modelo para estudar gal-3.