Impact of immune blockade receptor PD-1 in p53wt tumor cells

Abstract

Cancer is one of the leading causes of death, both in humans and dogs. Immunotherapies that target immune blockade receptors have been of particular interest over the past few years. Programmed cell death-1 (PD-1) is an immune blockade receptor expressed in activated T cells, B cells, and myeloid derived cells. In healthy individuals, PD- 1 and its ligands, PD-L1 and PD-L2 play an important role in the maintenance of peripheral tolerance by inhibition of T cell function. However, some tumor types express PD-L1, that when bound to PD-1 on activated T cells shuts down the immune response. Recent findings of this group, along with studies of other groups revealed PD-1 expression in tumor cells. The main objective of this thesis was to define whether canine cancer cells can produce tumor intrinsic PD-1 using two novel monoclonal antibodies and to develop cell based assays to define the PD-1 expression, regulation, and function of canine tumor cells. Two monoclonal antibodies were generated previously through immunization of mice with canine extracellular antigen and fusion with two distinct hybridomas. The monoclonal antibodies specificity was tested using different assays, such as ELISA, FACS, and immunofluorescence. Two OSA PD-1 +/- stable cell lines were created to characterize PD-1 expression on canine osteosarcoma. The generated monoclonal antibodies were showed previously to recognize and bind to PD-1 not only in normal tissue, but also melanoma and osteosarcoma tissue samples. In this thesis, different assays revealed that although both monoclonal antibodies have similar specificity they recognize different epitopes. Clonogenic assay of OSA31 PD-1 +/- cells compared with the glioma cell lines J3T PD- 1 +/- revealed that PD-1 enhances cell tumor growth in canine osteosarcoma but suppresses growth in glioma. It was also shown that PD-1 enhanced cellular migration in the canine osteosarcoma cells. This work suggest that PD-1 has a role in tumor cell growth and migration in canine osteosarcoma.

O cancro é uma das principais causas de morte, em humanos e cães. Imunoterapias que têm como alvo os recetores de bloqueio imune têm sido de particular interesse nos últimos anos. PD-1 é um recetor de bloqueio imune expresso em células T, células B e células mieloides ativadas. Em indivíduos saudáveis, PD-1 e os seus ligandos PD-L1 e PD-L2, representam um papel importante na manutenção da tolerância periférica através da inibição das células T. No entanto, alguns tipos tumorais expressam PD-L1, que quando ligado a PD-1 em células T ativadas desliga a resposta imune. Estudos recentes deste e de outros grupos demonstraram a expressão de PD-1 em células tumorais. O principal objetivo desta tese foi definir se as células cancerígenas caninas são capazes de produzir PD-1 tumoral intrínseco, através da utilização e dois novos anticorpos monoclonais, bem como o desenvolvimento de ensaios celulares para definir a expressão, regulação e função de PD-1 em células tumorais caninas. Dois anticorpos monoclonais foram previamente desenvolvidos através da imunização de ratos com antigénio extracelular canino e fusão com dois hibridomas distintos. A especificidade dos anticorpos monoclonais foi testada com recurso a diferentes ensaios, nomeadamente ELISA, FACS e imunofluorescência. Duas linhas celulares estáveis OSA31 PD1 +/- foram criadas para caracterizar a expressão de PD-1 em osteossarcoma canino. Os anticorpos monoclonais demonstraram previamente o reconhecimento e ligação a PD-1 não apenas em tecido normal, mas também em melanoma e osteossarcoma. Nesta tese, diferentes ensaios revelaram que embora os anticorpos representem especificidade similar, reconhecem diferentes epítopos. O ensaio clonogénico em células OSA31 PD-1 +/- em comparação com as linhas celulares de glioma J3T PD-1 +/- revelou que PD-1 aumenta o crescimento tumoral em osteossarcoma canino mas suprime em glioma. Foi também demonstrado que PD-1 aumenta a migração celular. Os dados aqui apresentados sugerem que PD-1 tem um papel no crescimento e migração de células de osteossarcoma canino.