The yeast DEL assay with dominant genetic markers

Abstract

The yeast DEL assay is a genotoxicity test that works by measuring the frequency of reversion of two disrupted his3 alleles sharing approximately 400 bp of homology by intrachromosomal recombination. This event leads to recovery of histidine prototrophy and deletion (DEL) of the intervening LEU2 marker and leucine auxotrophy. This assay has provided results displaying high correlation for well-known carcinogens with standardized and validated in vitro genotoxicity assays such as the Ames test. In this work, a novel version of the yeast DEL assay containing dominant genetic markers (dDEL) using antibiotic resistance genes KanR and Hph was developed to expand its application to wild-type yeast strains. The dDEL system enables quantitative measurement of genotoxicity using industrially relevant yeast strains lacking auxotrophic markers. For the construction of the dDEL assay, a shuttle plasmid was assembled from seven linear DNA fragments as a genetic support of the dDEL system, part of which was subsequently integrated in the HIS3 locus of the desired strains. The genetic constructions were performed through the yeast homologous recombination machinery. The yeast dDEL system was established in the laboratory strains CEN.PK 112-3A and RS112 (substituting the original DEL cassette), and in the industrial ethanol production strain PE-2. The functionality of the dDEL assay was assessed with hydrogen peroxide in a comparison with the original DEL assay. The DEL and dDEL systems in laboratory strains performed in a similar manner, and, interestingly, dDEL presented the highest relative increase in the recombination frequency. The dDEL assay in the PE-2 strain was used to evaluate the genotoxicity of furfural, which is a main fermentative inhibitor present in lignocellulosic hydrolysates. In this work, furfural was positively detected as genotoxic by the RS112 strain, although it displayed no clear genotoxic damage in the PE-2 strain, perhaps reflecting differences in the DNA repair machinery. This result supports the notion that performing genotoxicity resistance and other tests in the desired relevant biotechnological strains is vital in order to select stronger and more robust industrial yeast strains for a specific purpose.

O ensaio DEL em levedura é um teste de genotoxicidade que funciona através da medição da frequência de reversão de dois alelos his3 interrompidos, partilhando aproximadamente 400 pb através de recombinação intracromossomal. Este evento leva à recuperação da prototrofia para a histidina e a supressão (DEL) do marcador interruptor LEU2 e à auxotrofia para a leucina. Este ensaio forneceu resultados com alta correlação para carcinogéneos bem conhecidos com ensaios in vitro de genotoxicidade padronizados e validados, tal como o teste de Ames. Neste trabalho, foi desenvolvida uma nova versão do ensaio DEL em levedura, contendo marcadores genéticos dominantes (dDEL) usando os genes de resistência a antibióticos KanR e Hph, para expandir a sua aplicação a estirpes de levedura selvagens. O sistema dDEL permite a medição quantitativa de genotoxicidade usando estirpes de leveduras industrialmente relevantes sem marcadores auxotróficos. Para a construção do ensaio dDEL, foi elaborado um plasmídeo vaivém a partir de sete fragmentos lineares como suporte genético para o sistema dDEL, parte do qual foi depois integrado no locus genómico HIS3 nas estirpes desejadas. As construções genéticas foram desempenhadas através da maquinaria de recombinação homóloga de levedura. O sistema dDEL foi construído nas estirpes laboratoriais CEN.PK 102-3A e RS112 (para substituir a cassete DEL original), e na estirpe industrial produtora de etanol PE-2. A funcionalidade do ensaio dDEL foi avaliada com peróxido de hidrogénio em comparação com o ensaio DEL original. Os sistemas DEL e dDEL em estirpes laboratoriais tiveram um desempenho semelhante e, curiosamente o dDEL apresentou o mais elevado aumento relativo da frequência de recombinação. O ensaio dDEL na estirpe PE-2 foi usado para avaliar a genotoxicidade de furfural, que é um dos principais inibidores presente em hidrolisados lenhocelulósicos. Neste trabalho, o furfural foi positivamente detectado como genotóxico pela estirpe RS112, contudo não demonstrou danos genotóxicos evidentes na estirpe PE-2, possivelmente reflectindo diferenças na maquinaria de reparação de DNA. Este resultado apoia a noção de que o desempenho de testes de resistência à genotoxicidade, entre outros, nas estirpes industriais desejadas é crucial para se selecionar estirpes industriais de levedura mais robustas para um propósito específico.