Development and optimization of cultivation systems and techniques in order to improve cyanotoxin productivity and cost effectiveness

Abstract

Microcystis aeruginosa and its toxins, microcystins (MCs), constitute a threat for humans and animals. This cyanobacterium is spreading across the globe and with that, the risk of exposure to MCs arises, mainly through water consumption and aquatic recreational activities. Despite of the negative impact of these toxins, which was already responsible for several human and animal deaths, there is a huge biotechnological potential since MCs can be used in scientific research and environmental risk assessment studies. Additionally, MCs are also pointed as a promising agent to treat/reduce symptoms associated with cancer and Parkinson’s disease. Therefore, this study focused on increasing the cost-effectiveness of the production process of MCs through the optimization of: i) environmental factors that affect cell growth and toxin production; ii) different growth strategies to enhance toxin productivity; and iii) downstream processing. The synergistic interactions between light intensity, CO2 concentration, temperature, and pH unveiled significant impacts on M. aeruginosa’s growth-related parameters and toxicity. The combined use of low to medium light intensities (50–120 μmolphotons.m−2.s−1) and CO2 concentrations (1–6 % v/v) led to higher cell concentrations, while specific growth rate and biomass productivity were favoured by medium to high light intensities (110–190 μmolphotons.m−2.s−1), CO2 concentrations (4– 9.5 % v/v) and temperatures (29–39 °C). Regarding MCs production, higher concentrations were obtained at low light intensities and low CO2 concentrations. Conversely, approximately 2000-fold lower MCs concentrations were achieved by simultaneous use of high values of light intensity (> 140 μmolphotons.m−2.s−1) and CO2 concentration (> 6 % v/v). The cyanobacteria growth was greatly affected by the type of photobioreactor (PBR) utilized, providing different light exposure and distribution of cells inside the vessel due to specifities of the flow patterns of the culture. These factors are influenced by the hydrodynamics of the system that, in turn, has impact on the system’s mass transfer parameters. Bubble column (BC) and flat panel (FP) PBRs reached higher biomass concentrations than split cylinder airlift (SCA) – 76 and 98 %, respectively. This is an interesting finding since both PBRs present a continuously illuminated surface which is approximately 20 % lower when compared to that of SCA. With respect to maximum biomass productivity (Pmax) and specific growth rate (μmax), FP also showed the best results – up to 40 and 57 % higher, respectively. A two-stage growth approach was also tested as strategy to optimize MCs productivity. In a first phase, the conditions were set to maximize the cyanobacteria growth, followed by a second phase where growth conditions were changed in order to induce MCs accumulation. As result, the initial stage has presented the highest Pmax (≈ 0.088 g.L-1.d- 1) and μmax (≈ 0.025 d-1), whilst a 67 % increment of MCs concentration was reached in the second stage when compared to control. The M. aeruginosa growth and MCs accumulation has demonstrated to be considerably affected by the presence of filtrates and extracts of other photosynthetic microorganisms. The highest growth enhancement (17 %) was achieved with 20 % of extract of non-toxic M. aeruginosa (NTMASF20). The production of toxin in this culture was however similar to the control. Applying 20 % of filtrate of S. obliquus (SOF20) and extract of C. vulgaris (CVSF20), there was an inhibition of toxic M. aeruginosa growth of approximately 13 and 12 %, respectively. The impact on MCs accumulation was inexistent for CVSF20, while SOF20 resulted in an increment of 37 %. However, the conditions that resulted in a higher production of MCs were 20 % of filtrate (CEF20) and 10 % of extract of C. emersonii (CESF10), with concentrations roughly 49 and 58 % greater than the control, respectively. Several harvesting methods were tested, optimized and compared. Among the pHinduced flocculation tests, the highest harvesting efficiencies (HEs) were achieved at pH 3 and 4 – HEs > 90 % after 8 h. The adjustment of zeta potential (ZP) to values comprised between -6.7 and -20.7 mV enhanced significantly the settling rates using flocculation agents. The best results were obtained with FeCl3 where the HE was incremented in 88 % by ZP adjustment, achieving 92 % in 4 h. The use of iron oxide magnetic microparticles (IOMMs) has shown to be a very promising alternative to conventional harvesting methods once it allowed reaching HEs of 93.6 % with just 4 min of treatment. The optimal conditions verified for this methodology were a IOMMs:cells (g/g) ratio of 0.8:1 and pH 12. Different cell disruption methods were also tested, optimized and compared. The optimal conditions found for each disruption method tested were: i) 20 % of beads and treatment time of 7 min (bead milling); ii) 800 W for 1.5 min (microwave); iii) three 12- h freezing cycles at -20 ˚C (freeze-thaw cycles - FTC); iv) 15000 rpm for 7 min (highspeed homogenization - HSH); and v) 40 kHz for 10 min (sonication). Sonication and FTC followed by sonication revealed to be the most efficient methodologies to apply on MCs release and IOMR. The impact on cells’ viability was though more evident in FTC, FTC followed by sonication, and microwave where only 0.3, 0.05 and 0.9 % of the initial cells, respectively, maintained their viability after being treated. On the other hand, sonication and bead milling reduced the viability of the original culture to 5 and 15.5 %, respectively, while the HSH did not show any significant differences compared to control. The results obtained in this thesis, as well as the optimization of several steps of the production process of MCs by M. aeruginosa, allowed concluding that the improvement of the cost-effectiveness of the process is feasible and that a widespread use of such toxins in various biotechnological fields might become a reality in the future.

Atualmente, a Microcystis aeruginosa e as suas toxinas, microcistinas (MCs), constituem uma ameaça para seres humanos e animais. Esta cianobactéria tem-se disseminado um pouco por todo o globo, o que acarreta sérios riscos de exposição às MCs nomeadamente através do consumo de água ou de contacto através de atividades aquáticas recreativas. Apesar do impacto negativo que as MCs podem ter – já foram inclusive responsáveis por várias mortes de pessoas e animais –, estes compostos apresentam também um enorme potencial biotecnológico, uma vez que são utilizados para investigação científica e em estudos de avaliação de risco ambiental. Além disto, estas toxinas foram também apontadas como muito promissoras para tratar ou reduzir sintomas associados a cancro ou à doença de Parkinson. Consequentemente, este trabalho focou-se no aumento do custo-benefício do processo produtivo da MC através da otimização de: i) fatores ambientais que afetem o crescimento celular e a produção de toxina; ii) diferentes estratégias de crescimento para melhorar a produtividade da toxina; e iii) processamento a jusante. As interações sinergísticas entre intensidade de luz, concentração de CO2, temperatura e pH revelaram ter um impacto significativo no crescimento de M. aeruginosa e correspondente toxicidade. A utilização combinada de intensidades de luz (50–120 μmol fotões.m−2.s−1) e concentrações de CO2 (1–6 % v/v) baixas a intermédias levou a maiores concentrações celulares, enquanto que a taxa específica de crescimento e a produtividade de biomassa foram favorecidas por intensidades de luz (110–190 μmol photons.m−2.s−1), concentrações de CO2 (4–9.5 % v/v) e temperaturas (29–39 °C) intermédias a altas. Relativamente à produção de toxina, as maiores concentrações foram alcançadas utilizando baixas intensidades de luz e concentrações de CO2. Pelo contrário, concentrações de MCs cerca de 2000 vezes inferiores foram obtidas através do uso simultâneo de altas intensidades de luz (> 140 μmol fotões.m−2.s−1) e concentrações de CO2 (> 6 % v/v). O crescimento de cianobactérias foi bastante influenciado pelo tipo de fotobioreator utilizado que, por sua vez, afeta a exposição das células à luz e a sua distribuição no interior do reator, o padrão do fluxo da cultura e também todos os parâmetros hidrodinâmicos e de transferência de massa. A coluna de bolhas e o reator de placas atingiram concentrações celulares superiores às observadas no airlift – 76 e 98 %, respetivamente. Este facto é bastante interessante, tendo em conta que a superfície continuamente iluminada apresentada por ambos os fotobioreatores é menor em cerca de 20 % da correspondente ao airlift. Quanto à produtividade máxima de biomassa (Pmax) e à taxa específica de crescimento máxima (μmax), o reator de placas voltou a apresentar os melhores resultados – até cerca de 40 e 57 % maiores, respetivamente. Implementou-se também uma estratégia de crescimento em duas fases de forma a otimizar a produtividade de toxina. Na primeira fase, as condições de crescimento foram definidas no sentido de maximizar o crescimento celular, seguindo-se uma segunda fase onde as condições foram alteradas de modo a induzir a acumulação de MCs. Como esperado, a primeira fase apresentou os valores de Pmax (≈ 0.088 g.L-1.d-1) e de μmax (≈ 0.025 d-1) mais elevados, enquanto que na segunda fase foi registado um aumento de 67 % da concentração de MCs quando comparada com a do controlo. O crescimento de M. aeruginosa e a acumulação de MCs foram consideravelmente afetados pela presença de filtrados e extratos de outros microrganismos fotossintéticos. O maior incremento no crescimento, cerca de 17 %, foi obtido com 20 % de extrato da estirpe não-tóxica de M. aeruginosa (NTMASF20). No entanto, neste caso a produção de toxina manteve-se semelhante à do controlo. Nas culturas em que foram adicionados 20 % de filtrado de S. obliquus (SOF20) e de extrato de C. vulgaris (CVSF20) houve uma inibição do crescimento de aproximadamente 13 e 12 %, respetivamente. O impacto na produção de MCs foi inexistente para CVSF20, enquanto que SOF20 resultou num aumento de 37 %. Ainda assim, as condições que resultaram na maior produção de MCs foram a utilização de 20 % de filtrado (CEF20) e 10 % de extrato de C. emersonii (CESF10), com as concentrações a ultrapassarem o controlo em cerca de 49 e 58 %, respetivamente. Testaram-se, otimizaram-se e compararam-se vários métodos de colheita. De entre os testes de floculação induzida por pH realizados, as maiores eficiências de colheita ocorreram a pH 3 e 4 – eficiências > 90 % após 8 h. O ajuste dos valores de potencial zeta a valores compreendidos entre -6.7 e -20.7 mV aumentou significativamente as taxas de sedimentação usando agentes floculantes. Os melhores resultados foram obtidos com FeCl3 onde a eficiência de colheita registou subidas até 88 %, atingindo eficiências de 92 % em 4 h. A utilização de micropartículas magnéticas de óxido de ferro provou ser uma alternativa promissora aos métodos convencionais, uma vez que possibilitou a obtenção de eficiências de colheita de 93.6 % em apenas 4 min. As condições ótimas definidas para esta metodologia foram a utilização de pH 12 e um rácio partículas:células (g/g) de 0.8:1. Testaram-se, otimizaram-se e compararam-se também diferentes métodos de rutura celular. As condições ótimas definidas para cada um dos métodos de rutura celular testados foram as seguintes: i) 20 % de esferas de vidro e 7 min de tratamento (moinho de bolas); ii) 800 W durante 1.5 min (microondas); iii) três ciclos de congelamento de 12 h a -20 ˚C (congelamento-descongelamento); iv) 15000 rpm durante 7 min (homogeneização de alta velocidade); v) 40 kHz durante 10 min (sonicação). A sonicação e o congelamento-descongelamento seguido de sonicação revelaram ser os métodos mais eficientes para a extração de MCs e para a libertação de matéria orgânica intracelular. Contudo, o impacto na viabilidade celular foi mais evidente no caso do congelamento-descongelamento, congelamento-descongelamento seguido de sonicação e microondas, onde apenas 0.3, 0.05 e 0.9 % das células da cultura inicial, respetivamente, se mantiveram viáveis após serem tratadas. Por outro lado, a sonicação e o moinho de bolas reduziram a viabilidade da cultura original para 5 e 15.5 %, respetivamente, enquanto que a homogeneização de alta velocidade não apresentou alterações significativas quando comparada com o controlo. Os resultados obtidos nesta tese, assim como a otimização de várias etapas do processo de produção de MCs através de M. aeruginosa, permitiram concluir que é possível aumentar o custo-benefício do processo e que uma utilização alargada destas toxinas em múltiplos sectores biotecnológicos pode tornar-se uma realidade no futuro.